Le criblage de composés organiques plus petits appelés fragments à l’aide de la cristallographie aux rayons X est une méthode efficace pour identifier les molécules qui sont des points de départ pour la découverte de médicaments ou le développement de composés d’outils biochimiques. Le criblage cristallographique de fragment a révélé non seulement l’identité, mais aussi où et comment les fragments se lient à la surface de la protéine étudiée. Cette technique peut être utilisée sur chaque cible protéique biochimiquement ou médicalement pertinente pour laquelle des cristaux protéiques appropriés peuvent être cultivés.
La qualité des résultats est intimement liée à la qualité de la manipulation de l’échantillon. Nous croyons que la démonstration visuelle suivante aidera les chercheurs à mener des expériences de haute qualité. Tatjana Barthel, chercheuse au doctorat et doctorante dans mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.
Pour commencer, ouvrez le sac de la plaque de criblage préchauffé à température ambiante, puis retirez le couvercle et la feuille de la plaque de criblage. Décanter la solution de trempage de cinq millilitres dans le réservoir de réactif. Remplissez ensuite chacun des 96 réservoirs de la plaque avec 40 microlitres de solution de trempage à l’aide d’une pipette à 12 canaux.
Placez le cadre facile d’accès sur le dessus de la plaque de criblage et fixez-le avec les pinces incluses en les faisant glisser sur les côtés gauche et droit de l’appareil. Placez la plaque de criblage et le cadre d’accès facile sous le microscope et lame ouvrez le premier puits en déplaçant la tuile de verre acrylique respective du cadre. Ajouter 0,4 microlitres de solution de trempage du réservoir au puits contenant le fragment à l’aide d’une pointe de pipette fraîche.
Assurez-vous que la goutte recouvre le fragment séché. Placez la plaque de cristallisation qui contient les plus gros cristaux sous le deuxième microscope et coupez la feuille d’étanchéité à l’un des puits. À l’aide d’une boucle de taille appropriée, transférer un cristal dans le puits de la plaque de criblage sous le premier microscope.
Lavez la boucle dans la plaque de verre préparée, puis séchez-la en la touchant doucement au tissu. Faites-le après chaque transfert pour éviter la contamination croisée. Utilisez le microscope pour vous assurer que le cristal a été correctement placé.
Répétez la procédure pour le deuxième cristal. Passez au puits suivant et répétez la procédure pour tous les puits restants. Une fois que les cristaux ont été transférés dans les 96 puits de la plaque de criblage, retirez la plaque de criblage ainsi que le cadre facile d’accès sous le microscope et placez-le sur le banc ou la table.
Retirez ensuite le cadre facile d’accès de la plaque de criblage, scellez la plaque de criblage avec une feuille d’étanchéité et placez-la dans l’incubateur ou le placard de cristallisation pour incuber pendant le temps de trempage précédemment optimisé. Deux heures d’incubation suffisent, mais une nuit peut être plus pratique. Préparez la mousse Unipuck Dewar avec trois couvercles Unipuck et remplissez-la moitié d’azote liquide, en la gardant sur le sol.
Déplacez le Dewar à moitié rempli sur le banc et remplissez-le complètement jusqu’au bord même. Gardez-le rempli jusqu’au bord supérieur pendant toute l’expérience et remplacez fréquemment l’azote liquide. Récupérez la plaque de criblage de l’incubateur et retirez sa feuille.
Placez le cadre facile d’accès sur le dessus. Faites glisser le premier puits. Récoltez un cristal de la goutte et refroidissez-le par flash dans de l’azote liquide en plongeant avec un mouvement vertical rapide.
Insérez l’échantillon dans la bonne position de rondelle et prenez les notes pertinentes sur la feuille de suivi de l’échantillon. Répétez la procédure pour le deuxième cristal. Allez au puits suivant et répétez le positionnement des autres cristaux jusqu’à ce que les trois rondelles soient pleines.
Pré-refroidir les bases Unipuck dans de l’azote liquide et les ajouter sur les couvercles. Stockez les Unipucks dans un rack de stockage dans un Dewar de transport ou un Dewar de stockage. Conservez-les dans de l’azote liquide à des températures cryogéniques jusqu’à mesure.
Répétez la même procédure de récolte et de stockage des cristaux dans Unipucks pour les échantillons restants dans la plaque de criblage. La variabilité des morphologies cristallines après avoir effectué le trempage des fragments et la récolte des cristaux est illustrée ici. Même les cristaux qui semblent quelque peu détériorés ont été inclus, car ils donnent toujours des données utiles.
Les données ont été recueillies aux lignes de faisceau 14.1 et 14.2 au synchrotron BESSY II. La collecte de données par diffraction a été effectuée pour chaque échantillon. Les données ont été analysées à l’aide de FragMAXapp, en se concentrant sur la combinaison de XDSAPP pour le traitement, fspipeline pour l’amélioration de la structure et PenDA pour la recherche de succès.
Cela a entraîné 15 coups sur le complexe de protéines AR en utilisant une condition de trempage libre de DMSO. Lors d’une campagne précédente de l’écran d’entrée F2X contre la même cible, y compris le DMSO dans l’état de trempage, 20 coups ont été trouvés. Cela signifie que 75% des résultats peuvent être identifiés si DMSO est omis.
Pour le succès de l’expérience, il est crucial que les cristaux soient manipulés correctement et soigneusement à chaque étape de la procédure. Le criblage de fragments cristallographiques a mûri pour devenir une technique largement utilisée, qui est souvent appliquée dans le milieu universitaire et dans l’industrie pharmaceutique.
