En utilisant ce protocole, l’oxyde de deutérium, ou D2O, un isotope non radioactif et stable de l’eau, peut être utilisé pour estimer la composition corporelle et la consommation d’eau. Cette technique n’est pas invasive et peut donc être utilisée pour évaluer la composition corporelle des espèces menacées, ainsi que chez l’homme et les espèces domestiques. Une application unique de la technique de dilution de l’oxyde de deutérium est la capacité de mesurer la consommation d’eau de la faune en liberté avec des taux élevés de recapture ou d’animaux socialement logés.
Bien que l’anesthésie ne soit pas nécessaire, il peut être plus facile pour ceux qui ne sont pas familiers avec donner des injections sous-cutanées de sedate les animaux avant de livrer l’oxyde de deutérium. Amanda Eshelman et Ashley Cowan, étudiantes vétérinaires, et Alicia Roistacher, étudiante diplômée de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure avec Sarah Hooper et moi. Pour faire une solution de stock de 50 millilitres de neuf grammes par litre d’oxyde de deutérium salinisé, pesez d’abord 450 milligrammes de chlorure de sodium de qualité pharmaceutique, et enregistrez la quantité exacte à quatre décimales.
Transférez tout le sel dans un bécher stérilisé de 100 millilitres et mesurez 50 grammes d’oxyde de deutérium plus grand ou égal à 99,8 % dans un cylindre stérile gradué. Enregistrez la quantité exacte d’oxyde de deutérium à quatre décimales et transférez l’oxyde de deutérium au bécher stérile de chlorure de sodium. Ensuite, fixez une aiguille de calibre 20 à un filtre à disque nonpyrogène et stérile avec des pores submicron munis d’un canon de seringue de 10 millilitres, et insérez l’aiguille dans le septum d’un flacon stérile, vide et de 100 millilitres.
Fixez un tube à vide à une aiguille de calibre 22 et insérez l’aiguille dans le septum du flacon de 100 millilitres. Chargez ensuite 10 millilitres de chlorure de sodium isosmotique dans le baril de seringue et allumez lentement le vide jusqu’à ce que la solution d’oxyde de deutérium commence à filtrer lentement dans le flacon. Continuer à verser la solution de stock d’oxyde de deutérium dans le baril de seringue jusqu’à ce que tout le volume de 50 millilitres ait été filtré.
Après avoir confirmé un manque de réponse au pincement des orteils dans une chauve-souris anesthésiée, utilisez un tampon de préparation à l’alcool pour nettoyer l’uropatagium au-dessus de la veine interfémorale et laissez sécher la membrane de la queue désinfectée. Appliquez une fine couche de gelée de pétrole sur la veine interfémorale et utilisez une aiguille de calibre 29 pour percer la partie dorsale de la veine interfémorale. Utilisez ensuite des tubes capillaires en plastique d’héparine de sodium pour recueillir 100 microlitres de sang.
Pour assurer un mélange adéquat du sang entier avec l’héparine de sodium, roulez doucement chaque tube après la collecte de sang avant l’étiquetage. Après avoir déterminé la masse d’oxyde de deutérium en grammes à injecter, chargez une seringue à insuline munie d’une aiguille de calibre 29 avec le volume approprié d’oxyde de deutérium. Pesez la seringue et l’aiguille d’insuline chargées de deutérium, en enregistrant le poids à quatre décimales, et injectez tout le volume d’oxyde de deutérium sous-cutanée sur la région dorsale de la hanche de la chauve-souris anesthésiée.
Nous vous recommandons d’utiliser une balance de précision avec un bouclier antistatique et de nous assurer de reculer sur le piston pour assurer une pression négative avant l’injection. Immédiatement après l’injection, pesez la seringue et l’aiguille d’insuline maintenant vides, et enregistrez le poids à quatre décimales. Dans les 30 minutes qui ont été faites après la collecte de sang, utilisez une centrifugeuse hématocrit pour faire tourner chaque tube capillaire à 10 000 fois g pendant cinq minutes.
À l’aide de ciseaux pointus, couper le tube capillaire en plastique entre le sang entier et le plasma, et utiliser une pipette de 200 microlitres pour expulser le plasma directement dans un tube de stockage étiqueté de 500 microlitres. Après la période d’équilibrage, recueillir et stocker 100 autres microlitres de sang de la veine interfémorale comme nous venons de le démontrer. Pour l’analyse de la spectrophotométrie FTIR, réglez la température d’un bain de sable à 60 degrés Celsius pour faciliter la distillation, et ajoutez 50 microlitres de chaque échantillon de plasma et standard en bouchons de microcentrifugeuses coniques de 1,5 millilitre.
Garder le bouchon de microcentrifugeuse à l’envers, visser le tube de microcentrifugeuse conique de 1,5 millilitre sur le bouchon et placer le tube inversé en contact avec le sable dans le bain de sable pendant au moins 12 heures. Le lendemain matin, placez un nouveau bouchon propre sur chaque tube et pulsez les tubes de microcentrifugeuse pendant 10 secondes dans une microcentrifugeuse. Installez une cellule de transmission liquide dans le spectromètre FTIR et remplissez la cellule de méthanol.
Connectez le port d’injection et remplissez lentement la cellule d’eau de fond tout en enlevant soigneusement la seringue de méthanol pour réduire le risque de bulles d’air. Fixez le tube au port de sortie pour permettre l’enlèvement des échantillons après analyse et ouvrez le logiciel spectromètre FTIR. Définissez les paramètres selon le tableau et recueillez un échantillon de fond à l’aide de l’eau distillée filtrée de 0,22 micromètre.
Injectez 40 microlitres d’une norme d’oxyde de deutérium de zéro partie par million, enregistrez et enregistrez les spectres sous la forme d’un fichier de valeurs séparé de la virgule. Après avoir injecté et sauvé les spectres de toutes les normes pour créer une courbe standard, injecter 40 microlitres de chaque échantillon distillé dans la cellule de transmission liquide, et enregistrer les spectres. Avec un temps d’équilibre connu, l’eau corporelle totale, la masse maigre du corps, et la masse grasse corporelle pour les grosses chauves-souris brunes capturées à l’état sauvage et les grosses chauves-souris brunes captives peuvent être déterminées.
Une masse grasse corporelle négative peut être calculée en raison d’une ou plusieurs des raisons suivantes : ne pas recevoir toute la dose d’oxyde de deutérium, devenir torpeur pendant la phase d’équilibrage, avoir des masses grasses anormalement grandes et des masses maigres minimales, ou avoir moins de trois à 5 % de graisse corporelle déterminée par absorptiométrie à deux rayons X. Ici, un pourcentage représentatif de graisse corporelle déterminé par la technique de dilution de l’oxyde de deutérium par rapport à l’absorptiométrie à rayons X double est montré. Les deux techniques sont bien corrélées, avec la masse grasse corporelle montrant de fortes corrélations entre la graisse corporelle et le poids corporel et avec la technique de dilution de l’oxyde de deutérium pas systématiquement sur ou sous-estimer la masse grasse corporelle.
La méthode de dilution de l’oxyde de deutérium a déjà été validée chez les chats, et la technique a été adaptée pour permettre la mesure de la consommation quotidienne d’eau des chats socialement logés au cours de chaque bloc alimentaire de l’expérience. Rappelez-vous que cette technique ne doit être effectuée que sur des animaux en bonne santé et que vous devez peser, enregistrer et livrer avec précision la dose complète d’oxyde de deutérium à chaque animal. Une méthode secondaire pour déterminer la composition corporelle, telle que l’analyse complète de carcasse ou DEXA, peut être accomplie pour valider la technique d’oxyde de deutérium.
Cette technique nous a permis d’identifier un chat socialement logé qui consommait des quantités anormalement élevées d’eau sans séparer chaque chat pour mesurer sa consommation d’eau.
