Les techniques automatisées de microscopie électronique de section de série. L’étape limite de taux dans le pipeline menant à la génération de modèles biologiques tridimensionnels de traitement d’image. Notre protocole fournit une ligne directrice étape par étape pour produire une construction plus dense des volumes d’images en seulement quelques jours.
Combiné avec une approche pour les mesures quantitatives à l’aide de modèles tridimensionnels. Avec cette technique, la structure 3D des tissus, autres que le cerveau, peut potentiellement être analysée pour identifier les déficiences structurelles typiques de certaines maladies et améliorer la stratégie diagnostique. La segmentation est une étape fastidieuse.
Prenez le temps de le rendre aussi précis que possible pour éviter de relire une mauvaise segmentation et d’avoir à redémarrer l’ensemble du processus. La conception du logiciel parfois pas très convivial. Par conséquent, il est important de voir le début des travaux sur la segmentation.
Ouvrez la pile d’images en faisant glisser et en laissant tomber le fichier natif du microscope contenant la pile ou acheter glisser et laisser tomber le dossier contenant toute la pile d’images dans la fenêtre logicielle Une fois que la pile est ouverte aller à l’image, propriétés, pour s’assurer que la taille voxels a été lu à partir des métadonnées. Transformez l’image en 8 bits en cliquant sur l’image, tapez et sélectionnez 8 bits. Si la pile d’origine est acquise sous forme de tuiles différentes, appliquez des coutures dans TrakEM2.
Créez un nouveau projet TrakEM2 à l’aide de nouvelles structures de segment de fonctions intégrées TrakEM2 au besoin. Dans le gluant du TrakEM2, cliquez à droite sur n’importe quoi sous la fenêtre de modèle, et sélectionnez ajouter la nouvelle liste de zone enfant’Drag et déposer n’importe quoi dans le dossier, sous les objets du projet et un n’importe quoi’irait là-bas. Faites glisser et déposer, la liste de zone’du modèle au anything’located sous project objects’On the image stack viewport, sélectionnez le Z-space’with the cursor.
La liste de zone’apparaîtra avec le numéro d’identification unique. Sélectionnez l’outil brush’out sur le dessus et utilisez la souris pour segmenter une structure en remplissant son cytosol sur l’ensemble de la pile Z. Exporter la masse segmentée, qui sera utilisée dans Ilastik comme graine pour la sculpture.
Pour ce faire, cliquez à droite soit sur l’objet de liste de zone sur la liste d’espace Z ou sur le masque dans le port de vue, et sélectionnez export’area list’as labels T-I-F. Selon la résolution nécessaire pour d’autres reconstructions, réduisez la taille des pixels de la pile d’images par échantillonnage vers le bas. Tenez compte des exigences de mémoire du logiciel qui sera utilisé pour la segmentation et la reconstruction.
Ilastik gère des piles de jusqu’à cinq cents pixels sur X-Y. Prenez en compte, la taille minimale que les objets semblent encore reconnaissables et peuvent donc être segmentées. Utilisez image’adjust size’Pour améliorer le contraste et aider la segmentation, le filtre masque flou peut être appliqué pour rendre les membranes plus nettes.
Utilisez process’filters’unsharp mass’Export the image stack as single images’for further processing in segmentation software, using file’save as’image sequence’and choose TIFF’format. Dans le gooey principal Ilastik, sélectionnez le module carving’module. Chargez la pile d’images, en utilisant add new’and ajouter un seul volume 3D/4D de sequence’Select répertoire entier’et choisissez le dossier contenant la pile d’images enregistrées en tant que fichiers unique’Au bas de la nouvelle fenêtre, où les options pour le chargement des images sont présentes, assurez-vous de garder Z"sélectionné.
Pour les étapes suivantes, toutes les opérations et boutons peuvent être trouvés sur le côté gauche de la gluante logicielle principale. Sous l’onglet pré-traitement, utilisez les options standard déjà vérifiées. Utilisez des filtres riches en lignes lumineuses et maintenez l’échelle du filtre à 1.600.
Ce périmètre peut être modifié par la suite. Une fois le pré-traitement terminé, sélectionnez la page suivante dans le menu décrochage du module d’étiquetage. Un objet et un arrière-plan sont présents par défaut.
Sélectionnez la graine de l’objet en cliquant dessus et tracez une ligne au-dessus de la structure d’intérêt. Ensuite, sélectionnez la graine de fond et dessinez une ou plusieurs lignes à l’extérieur de l’objet à reconstruire. Maintenant, cliquez sur segment’and attendre.
Selon la puissance de l’ordinateur et la taille de la pile, la segmentation peut prendre de quelques secondes à quelques heures. Une fois qu’il est fait, un masque semi-transparent mettant en évidence la segmentation doit apparaître sur le dessus de la structure segmentée. Faites défiler la pile pour vérifier la segmentation.
La segmentation, peut ne pas être exacte si elle ne suit pas la structure d’intérêt ou se déverse hors de lui. Corrigez tout déversement en plaçant une graine de fond sur la segmentation renversée. Et ajouter une graine d’objet sur le segment non reconstruit de l’objet d’intérêt.
Une relecture visuelle précise de la segmentation avec Ilastik peut être fastidieuse, mais il est essentiel de s’assurer que les objets exportés ne contiennent pas d’artefacts. Si la segmentation n’est toujours pas correcte, essayez de modifier avec le paramètre bias’parameter qui augmentera ou diminuera la quantité de pixels classifiés incertains acceptés. Sa valeur est de 0,95 par défaut.
Diminuez-le pour limiter tout débordement ou augmenter si la segmentation est trop conservatrice. Une autre possibilité est de cliquer sur le prétraitement et de modifier la taille du filtre. L’augmentation de la valeur minimisera les effets sonores du sel et du poivre, mais rendra également les membranes plus floues et les petits détails plus difficiles à détecter.
Cela pourrait limiter les retombées. Répétez autant que nécessaire tant que tous les objets désirés ont été segmentés. Une fois qu’un objet est terminé, naviguez vers segment’et cliquez sur enregistrer object’Two nouvelles graines apparaîtront pour commencer la segmentation d’un nouvel objet.
La surface abstraite mesure immédiatement les fichiers O-B-J en cliquant sur l’exportation de tous les modèles segmentés manuellement en 3D dans TrakEM2, liste de zone de clic droit, puis sélectionnez afficher en 3D’A une valeur plus élevée générera un maillage de résolution inférieure. Enfin, exportez le maillage 3D comme WaveFront O-B-J’en choisissant parmi les surfaces de file’export du menu’WaveFront’Après avoir installé la trousse d’outils neuromorphe décrite dans le protocole texte, mélangeur ouvert. Importez les objets à l’aide de l’importation de lots neuromorph en cliquant sur import objects’under le menu scène pour importer plusieurs objets à la fois.
Assurez-vous d’activer, d’utiliser le maillage et l’ombrage lisse. Sélectionnez l’objet d’intérêt du revêtement et modifiez la profondeur Octree de la fonction de re-maille sous le menu du modificateur. Travaillez itérativement pour minimiser le nombre de vertices et éviter de perdre des détails dans la résolution et la morphologie correcte.
Lors de la modification de la profondeur octree, le maillage sur le gluant principal va changer en conséquence. Une fois terminé, cliquez sur appliquer pour finaliser le processus. Accédez au menu neuromorphe sur le panneau gauche et utilisez les interactions de pile d’images de l’outil de superposition d’image pour charger la pile d’images.
Assurez-vous d’entrer la taille physique de la pile d’images pour X, Y et Z et sélectionnez le chemin de la pile en cliquant sur la source Z.X et Y sont des plans orthogonaux. Ils sont optionnels et ne seront chargés que si l’utilisateur insère le chemin valide. Ensuite, sélectionnez un maillage sur le port de vue en cliquant à droite dessus.
Entrez le mode modifier en appuyant sur l’onglet, sélectionnez un ou plusieurs vertices à l’aide du clic droit de la souris et cliquez enfin sur afficher l’image à vertex. Un ou plusieurs plans coupés avec le micrographe apparaîtront superposés au-dessus du maillage. Sélectionnez le plan coupé en cliquant à droite dessus.
Puis appuyez sur le contrôle Y et faites défiler le modèle 3D à l’aide du parchemin de la souris. Cela peut également être utilisé comme méthode de relecture. On y voit la segmentation et la reconstruction à l’aide de TrakEM2 et Ilastik.
Le gluant TrakEM2 est montré avec des objets segmentés manuellement en rouge. Le masque exporté peut ensuite être utilisé comme entrée pour la segmentation semi-automatisée. Depuis Ilastik, les masques peuvent être exportés vers TrakEM2 pour une relecture manuelle.
Les masques peuvent être exportés sous forme de mailles triangulaires 3D pour révéler des structures reconstruites. Dans cet exemple, quatre neurones, astrocytes, microglies et péricytes ont été reconstruits à l’aide de ce processus. Une analyse 3D des morphologies reconstituées à l’aide d’outils personnalisés est présentée.
Voici un volume d’image isotropique à partir d’un ensemble de données de microscopie électronique à balayage de faisceaux ion ciblés. Une reconstruction dense de ces données révèle les axones, le processus astrocytique et les dendrites. Ce micrographe montre des exemples de cibles pour des quantifications telles que des synapses et des granules astrocytiques de glycogène.
Le masque de ce micrographe montre la distribution de granules glycogènes autour des synapses. Il est indiqué ici une illustration graphique de l’entrée et de la sortie de la visualisation graphique du modèle d’absorption de lactate dérivé du glycogène ou GLAM’Here, un utilisateur est montré portant une réalité virtuelle ou un casque V-R tout en travaillant sur la reconstruction dense à partir d’un ensemble de données de microscopie électronique de balayage de faisceau d’ion focalisé. À partir d’un sous-ensemble de neurites, une scène immersive V-R peut être observée.
Le laser vert pointe vers un glam’peak. est d’une importance primordiale car il détermine la taille correcte des objets 3D exportés et détermine que ses mesures reflètent sa taille réelle. Le concept d’imagerie par section sérielle, de segmentation de l’imagerie et de construction 3D est assez ancien.
La découverte de l’accélération technique conduit à des progrès dans les colectomies dans la révision des manuels d’anatomie. Bien que la méthode ait été développée pour la recherche sur le cerveau en microscopie électronique, elle peut être généralisée à n’importe quelle technique de microscopie générant des données En outre, n’importe quel type de technique d’imagerie 3D peut bénéficier de telles techniques de segmentation et de construction d’imagerie. Y compris les scans C-T et M-R-I.
