The authors have nothing to disclose.

Cette étude a été réalisée en conformité avec les politiques énoncées dans le Guide pour l&#39;entretien et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire (NIH) approuvées par le Comité d&#39;éthique de l&#39;Université des sciences médicales de l&#39;Iran (Téhéran, Iran). 1. Les animaux, la chirurgie et spécimens Préparatifs NOTE: Préparer les tissus du cerveau pour l&#39;analyse microscopique confocale 3D. <ol><li> Diviser les animaux au hasard en deux groupes: le peptide Aß 1-40 -Injection (n = 8), et Aß 1-40 -Injection traitement avec la génistéine (n = 8); administrer la génistéine (10 mg / kg diluée dans un véhicule tel que l&#39;huile de ricin polyéthoxylée) par gavage 1 heure avant la chirurgie. </li><li> Anesthésier les animaux avec de la kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg). Confirmez anesthésie appropriée par le manque de réflexe de retrait après pincement de l&#39;orteil. Utilisez pommade sur les yeux pendant la chirurgie pour prévenir la sécheresse. </li><li> Placez animaux appareil stéréotaxique et de la tête de rasage. Appliquer IODine solution pour nettoyer le cuir chevelu avant l&#39;incision et de garder le site de l&#39;opération stérile pendant la chirurgie pour réduire le risque d&#39;infection. Injecter Aß 1-40 stéréotaxique (4 pi) dans l&#39;hippocampe à -3.5 mm derrière le bregma, ± 2 mm de la ligne médiane latérale, et -2.8 mm sous la dure, selon cerveau de rat atlas 8. Pour la méthode stéréotaxique s&#39;il vous plaît voir la publication précédente 9. </li><li> Fournir observation post-opératoire / soins jusqu&#39;à ce que les animaux sont pleinement conscients pour assurer le confort des animaux. Gardez les animaux au chaud lors de la récupération, et ne les renvoie pas à une cage avec les autres animaux jusqu&#39;à ce que la récupération complète. Faites attention à tout signe d&#39;infection chez les animaux après la chirurgie. </li><li> Anesthésier les animaux profondément par la kétamine (150 mg / kg) trois semaines après la chirurgie. Effectuer la fixation transcardial en perfusant les animaux avec saline à 0,9%, suivi par 4% de paraformaldehyde dans PBS 0,1 M (pH = 7,4), puis retirer et fixer le cerveau comme décrit dans 10 &lt;/ sup&gt;. </li><li> Post-fixer les cerveaux dans 4% de paraformaldehyde pendant 2-3 jours à 4 ° C. </li><li> Incluez le tissu dans des blocs de paraffine par l&#39;utilisation d&#39;équipements de enrobage de tissus, et d&#39;éviter la sous-remplissage ou de trop remplir la cassette car il peut interférer avec l&#39;alignement ou de sectionner correcte. Faites attention à l&#39;orientation du tissu dans le bloc de paraffine. NOTE: L&#39;hippocampe de rat, par exemple, est proche de la partie postérieure de l&#39;hémisphère cérébral. Ainsi, le tissu doit être intégrée dans une manière qui sectionnement commence à partie postérieure du cerveau. Utilisez l&#39;atlas de Paxinos 8 comme un guide pour atteindre la structure anatomique désiré. </li><li> Placez le microtome loin des courants d&#39;air ou des portes, car les mouvements de l&#39;air font de la manipulation des sections difficiles. </li><li> Utilisez sections avec un um d&#39;épaisseur ≥20 que cette profondeur avec soit nécessaire de produire des images Z-Stack de astrocytes complets. Ne pas utiliser les premières sections couple, car ils peuvent avoir une épaisseur indésirable en raison de e thermiqueXpansion. </li><li> Placez les sections sur la surface de l&#39;eau chaude (5 ± 2 ° C inférieure à la température de fusion de la paraffine) juste assez longtemps pour aplatir les sections. Remarque: Au cours de l&#39;expansion de la section peut perturber la morphologie de la structure. Utilisez petit pinceau pour transférer soigneusement sections. Recueillir deux à trois sections sur chaque diapositive. </li><li> Stocker les lames dans un rack dans une position verticale et laissez-les sécher à 37 ° C pendant plusieurs heures ou O / N. </li></ol> 2. immunohistochimie <ol><li> Déparaffiner sections de xylene, 2 x 10 min, et se réhydratent par gradient d&#39;alcool (99,8%, 95%, 70% et, 10 minutes chacun) et du PBS. </li><li> Incuber avec des anticorps contre la protéine gliale fibrillaire acide (GFAP) dilué à 1: 1500 dans du PBS contenant 0,25% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA), 0,25% de Triton X-100 à 3,5% et du sérum normal (O / N à 4 ° C). </li><li> Laver les coupes dans du PBS pendant 3 x 5 min. </li><li> Incuber avec phosphate alcalin conjugué secondaire antibodies pendant 1 h (1: 100, 21 ° C, dilué dans du PBS). </li><li> Laver les coupes dans du PBS pendant 3 x 5 min. NOTE: Il est important de se laver les sections correctement après Anticorps secondaires afin de minimiser la coloration de fond. </li><li> Incuber les coupes dans l&#39;obscurité avec liquide rouge permanent chromogène (15-20 min). Note: Préparer la solution pas plus de 30 min avant utilisation. </li><li> Laver les coupes dans du PBS pendant 3 x 5 min. </li><li> Enfin, colorer les noyaux avec 4-6-diamidino-2-phénylindole (DAPI; 1: 500, dilué dans du PBS) avant de couvrir-glisser. Conserver les diapositives dans le réfrigérateur 24-48 h avant la microscopie. </li></ol> 3. microscopie confocale REMARQUE: Pour l&#39;évaluation quantitative (voir ci-dessous), sélectionnez un astrocyte avec un noyau de DAPI teinté clairement visible avec un minimum de chevauchement des branches pour réduire le risque d&#39;erreurs. Produire des images Z-Stack prend du temps. Soyez patient et ne vous arrêtez pas au cours du traitement. Confocale à balayage laser vertical microscope est used pour créer des images 3D à partir des astrocytes. <ol><li> Mettez la lame sur le microscope-scène, et sélectionnez l&#39;objectif 63X. </li><li> Ouvrez le logiciel d&#39;imagerie et cliquez sur système Start. Cliquez sur l&#39;onglet Rechercher. Aller à céder, et sélectionnez GFP pour ajuster la lumière adéquate. </li><li> Ouvrez le déclencheur pour réfléchir la lumière. Trouver le réflecteur Revolver sur le côté droit de l&#39;obturateur et choisir la couleur qui devrait être reflétée par les astrocytes (vert, rouge ou violet); couleur rouge (FSet20 de WF) a été utilisé ici. REMARQUE: Ne pas oublier de mettre l&#39;image directement dans l&#39;oculaire du microscope. </li><li> Pour trouver la meilleure mise au point, cliquez sur All fermée, mettre la goupille de microscope en mode écran, puis cliquez sur l&#39;onglet Acquisition. </li><li> Cliquez sur Configuration Smart sous l&#39;onglet Acquisition; ouvre une fenêtre. Sélectionnez le fluorophore appropriée (c.-à-DAPI et Alexa Fluor 555, dans le projet actuel) dans la liste. La couleur est automatiquement sélectionné. </li><li> Cliquez sur meilleur signal, et sur Appliquer, puis cliquez sur Définir exposition; l&#39;ordinateur va alors régler automatiquement les paramètres d&#39;exposition. </li><li> Pour optimiser l&#39;image, allez dans la fenêtre Couches. Enlever Track2, mettez en surbrillance Track1 et cliquez sur Live. Concentrer l&#39;image si nécessaire. </li><li> Dans la fenêtre Chaînes ajuster les touches suivantes; cliquer sur 1AU pour optimiser automatiquement le sténopé. Il est très important de faire cette étape sinon les images confocales seront non-optimale. Régler le gain d&#39;avoir la meilleure intensité (garder ce réglage en dessous de 800 pour réduire le bruit en sus). Enfin, réglez le gain numérique entre 2 et 3. </li><li> Enlever Track1, cliquez sur Track2 et répétez l&#39;étape 3.8 pour Track2. Puis arrêtez Live. </li><li> Allez à la fenêtre Mode d&#39;acquisition. Améliorer l&#39;image en optimisant Taille de l&#39;image et de la moyenne. Pour changer la taille du cadre aller à X * Y et sélectionnez 1024 x 1024. Choisissez une vitesse lente pour créer une meilleure image. </li><li> Aller à la moyenne et sélectionner un numéro ≥4. Cette valeur moyenne indique le nombre de balayages qui sera en moyenne de productione l&#39;image acquise. Maintenant, cliquez sur le bouton Snap, et enregistrer l&#39;image 2D capturé. </li><li> Pour l&#39;imagerie 3D, marquer l&#39;élément Z-Stack sous Configuration Smart provoquant la fenêtre Z-Stack pour l&#39;ouvrir. </li><li> Régler les première et dernière positions pour le Z-Stack, à savoir la profondeur de la cellule. Cliquez d&#39;abord sur le Live. Ensuite, utilisez la commande de mise au point du microscope à se concentrer sur la position la plus élevée de astrocyte dans le tissu, où le Z-Stack est de commencer. Cliquez sur Set Premier. Puis se concentrer vers la position la plus basse de l&#39;astrocyte dans le tissu, où la numérisation Z-Stack doit être arrêté. Cliquez sur Set Dernier. Puis arrêtez Live. </li><li> Choisissez l&#39;intervalle; 1,01 um est utilisée dans la présente étude; intervalle choix peut être fait en cliquant sur Optimal pour définir le nombre de tranches. </li><li> Cliquez sur Début de l&#39;expérience. Enregistrez les images une fois la numérisation terminée. Cette image sera utilisée pour la mesure des paramètres suivants: surface spécifique et le volume du territoire des astrocytes, le soutien-gorge entier compris astrocyteNches, corps de la cellule, et le noyau. </li><li> Acquérir une image 2D en utilisant un objectif 10X ou 20X comme décrit dans les étapes 3.6-3.11. Cette image peut être utilisée pour la mesure de l&#39;intensité de fluorescence de l&#39;immunoréactivité des anticorps, des astrocytes et de la densité (nombre / 1000 um 2). </li></ol> 4. Astrocyte Densité et GFAP + Fluorescence Intensity <ol><li> Ouvrez l&#39;image 20X 2D. Cliquez sur Histo (Hisogram) sur le côté gauche de la fenêtre d&#39;image. </li><li> Pour calculer la densité des astrocytes, sélectionnez trois champs visuels consécutives relevant de l&#39;objectif 20X. Comptez le nombre d&#39;astrocytes qui présentent une soma clair avec moins de chevauchement des succursales dans les champs. </li><li> Pour quantifier l&#39;intensité de fluorescence, sélectionner un outil approprié (rectangulaire ou circulaire) sur le pied de page de la fenêtre d&#39;image, et de choisir une zone pour la mesure. Notez la valeur moyenne et l&#39;écart type apparaissent automatiquement sous l&#39;image. Dans l&#39;étude actuelle, une zone rectangulaire de 0,7 mm 2 entre striatum et la lame médiale du gyrus denté a été utilisé. </li></ol> 5. Branches d&#39;astrocytes <ol><li> Pour quantifier la longueur et le nombre total de branches, utilisez des images 3D (acquis avec 20X) dans le logiciel d&#39;analyse d&#39;image. Tracez une ligne manuellement le long de la longueur de chaque branche de l&#39;astrocyte sélectionné. Ensuite, sélectionnez la mesure-outil qui est spécialisé pour mesurer la longueur des lignes. Afin de quantifier le nombre de branches, sélectionnez le compte-outil pour compter le nombre de points marqués. </li></ol> 6. Volume et Superficie NOTE: Marquage manuellement une structure en 3D des logiciels d&#39;analyse d&#39;image exige une attention et de la formation. Pratiquer plusieurs fois avant de commencer une expérience. <ol><li> Pour quantifier la zone de volume et de surface de l&#39;astrocyte noyau, soma, corps cellulaire et territoire, transférer les images 3D (acquises dans les étapes 3.1-3.16) à un logiciel 3D d&#39;analyse d&#39;image tels que Volocity 6.1. </li><li> Ouvrez le logiciel et créer un nouveaubibliothèque. Faites glisser toutes les images à la colonne grise à gauche dans la nouvelle bibliothèque. Ensuite, sélectionnez une image 3D. Sur la droite, il existe différents canaux de couleurs différentes. Tourner sur un canal d&#39;intérêt; par exemple le canal bleu pour DAPI lors de la mesure du noyau. Changer manuellement la luminosité pour obtenir un contraste optimal. </li><li> Sélectionnez le menu Outils, aller à faire du volume et de produire une seule image 3D à partir d&#39;images Z-stack. Cliquez sur Propriétés dans le menu Edition et assurez-vous que X, Y et Z propriétés sont présentés; sinon il est impossible d&#39;effectuer une analyse 3D. </li><li> Cliquez sur Freehand icône de l&#39;outil de RIO dans la barre. Pour mesurer la zone de volume et de surface du noyau astrocyte tracer une ligne autour du noyau de DAPI marqué. </li><li> Pour mesurer la zone de volume et de surface du corps cellulaire d&#39;astrocytes tracer une ligne autour du soma hors branches. </li><li> Pour mesurer la zone de volume et de surface de l&#39;ensemble des astrocytes (du corps cellulaire y compris les succursales) tracer une ligne autour de la suite de la somasurface de toutes les branches. </li><li> Pour évaluer la zone de volume et de surface du territoire des astrocytes tracer une ligne entre les extrémités des branches. REMARQUE: Appuyez sur Suppr du clavier pour effacer les dessins indésirables. </li><li> Cliquez sur le menu Mesures en haut de la fenêtre d&#39;image pour créer un protocole de mesure; une fenêtre contenant différents outils ouvre. </li><li> Drag trouver des objets pour haut de la fenêtre (panneau). Donnez un nom descriptif à la population 1, sélectionnez la couleur associée, et cliquez sur Mesure. Une autre fenêtre ouvre. </li><li> Choisissez une zone paramètre-à-dire, le volume ou la surface. Cliquez sur OK. Les données apparaissent dans une table. </li><li> Pour enregistrer les données, cliquez sur le menu de mesure et sélectionnez Faire Point de mesure. </li><li> Sélectionnez un nouvel élément de mesure appelée à partir de la fenêtre ouverte. Ensuite, donner un nom aux données et cliquez sur OK. </li><li> Enfin, exporter les données vers un logiciel de statistiques telles que Graph Pad ou le programme exceller. Utilisez t-test pour analyser les données, puis tracer 2D grAPHS. </li></ol>

<ol>
	<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+and+magic+of+glia:+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease.">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li><li>Pellerin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+regulation+of+energy+metabolism+by+astrocytes:+an+update.">Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update.</a> Glia. 55 (12), 1251-1262 (2007).</li><li>Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes:+biology+and+pathology.">Astrocytes: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119 (1), 7-35 (2010).</li><li>Pekny, M., Nilsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+activation+and+reactive+gliosis.">Astrocyte activation and reactive gliosis.</a> Glia. 50 (4), 427-434 (2005).</li><li>Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+reactive+astrogliosis+and+glial+scar+formation.">Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation.</a> Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).</li><li>Anderova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death/proliferation+and+alterations+in+glial+morphology+contribute+to+changes+in+diffusivity+in+the+rat+hippocampus+after+hypoxia-ischemia.">Cell death/proliferation and alterations in glial morphology contribute to changes in diffusivity in the rat hippocampus after hypoxia-ischemia.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 31 (3), 894-907 (2011).</li><li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regulation+of+astroglial+morphology+and+proliferation+in+vitro.">Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro.</a> J Cell Biol. 100 (2), 384-396 (1985).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A stereotaxic atlas of the rat brain. , (1998).</li><li>Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+surgery+for+excitotoxic+lesion+of+specific+brain+areas+in+the+adult+rat.">Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat.</a> J Vis Exp. (65), e4079 (2012).</li><li>Bagheri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+beta(1-40)-induced+astrogliosis+and+the+effect+of+genistein+treatment+in+rat:+a+three-dimensional+confocal+morphometric+and+proteomic+study.">Amyloid beta(1-40)-induced astrogliosis and the effect of genistein treatment in rat: a three-dimensional confocal morphometric and proteomic study.</a> PloS One. 8 (10), e76526 (2013).</li><li>Chvatal, A., Anderova, M., Kirchhoff, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+confocal+morphometry+-+a+new+approach+for+studying+dynamic+changes+in+cell+morphology+in+brain+slices.">Three-dimensional confocal morphometry - a new approach for studying dynamic changes in cell morphology in brain slices.</a> J Anat. 210 (6), 671-683 (2007).</li><li>Kulkarni, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3-D+analysis+of+GFAP+labeled+astrocytes+from+fluorescence+confocal+images.">Quantitative 3-D analysis of GFAP labeled astrocytes from fluorescence confocal images.</a> J Neuroscie Methods. 15 (246), 38-51 (2015).</li><li>Wagner, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Object-based+analysis+of+astroglial+reaction+and+astrocyte+subtype+morphology+after+ischemic+brain+injury.">Object-based analysis of astroglial reaction and astrocyte subtype morphology after ischemic brain injury.</a> Acta Neurobiol Exp. 73 (1), 79-87 (2013).</li></ol>

Ce travail a été soutenu par des subventions du Conseil Comté d&#39;Östergötland, (Suède) et le Centre de recherche cellulaire et moléculaire à l&#39;Université des sciences médicales de l&#39;Iran (Téhéran, Iran).

Dans le protocole actuel, nous avons utilisé la morphométrie confocale 3D pour évaluer 12 paramètres différents qui ont été associés à la morphologie des astrocytes. A cet effet, l&#39;hippocampe de rats tissu avec Aß 1-40 - astrogliose induit, avec ou sans prétraitement de la génistéine en tant qu&#39;agent anti-inflammatoire ont été utilisés. En utilisant des images 3D et des logiciels morphométrique, nous avons pu montrer l&#39;effet de la génistéine sur astrogliose-à-dire la m...

En bonne santé du système nerveux central (SNC), les astrocytes jouent un rôle important dans la régulation de la circulation sanguine, le métabolisme énergétique, la fonction et la plasticité synaptique, et l&#39;ion extracellulaire et neurotransmetteur homéostasie 1-3. En outre, les astrocytes répondent à différents stimuli nocifs et les conditions anormales telles qu&#39;un traumatisme, une infection, une ischémie ou une neurodégénérescence via astrogliose réactif qui est caractérisée par une hypertrophie, la prolifération et le remodelage fonctionnel de 4,5 astrocytes. Astrogliose réactif peut concevoir la réponse inflammatoire et processus de réparation dans le tissu et, par conséquent, peuvent influer sur l&#39;issue clinique des interventions thérapeutiques. En conséquence, les astrocytes ont retenu l&#39;attention de neuroscientifique au cours des dernières décennies que des cibles potentielles pour des interventions thérapeutiques pour une variété de maladies affectant le système nerveux central. Les astrocytes ont normalement une forme stellaire avec bien defined branches qui se propagent à travers le soma 6. Dans un état ​​pathologique dans le cerveau, les branches d&#39;astrocytes deviennent compliquées et 7 montrent un gonflement des extrémités, par exemple en présence de bêta-amyloïde (Aß). Cet article présente un protocole d&#39;analyse d&#39;images 3D d&#39;astrocytes acquises par microscopie confocale. Douze paramètres quantitatifs différents pour chaque astrocytes ont été mesurés: les surfaces et les volumes du territoire des astrocytes (tissu couverte par une astrocytes), la cellule entière (y compris les succursales), corps de la cellule, et le noyau; la longueur totale et le nombre de branches; l&#39;intensité de fluorescence des anticorps utilisés pour la détection des astrocytes; et la densité des astrocytes (nombre / 1000 um 2). A cet effet, nous avons utilisé des coupes de cerveau de rats exposés à une injection intrahippocampique de Aß 1-40 avec ou sans traitement de génistéine en tant que substance anti-inflammatoire. Le protocole décrit peut être utilisé pour une morphométriealyse de différents types de cellules in vitro ou in vivo dans des conditions différentes.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amyloid beta 1-40</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>79793</td>
			<td>Keep in -70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genistein</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>446-72-0</td>
			<td>keep in -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Permanent Chromogen</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>K0640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid permanent Red Substrate Buffer</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>K0640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cremophor EL</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>27963</td>
			<td>Polyethoxylated castor oil - Step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.3</td>
			<td>Perkin Elmer Inc.,</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis 2000</td>
			<td>Tekno Optic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streotaxic apparatus</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph pad Prism 5</td>
			<td>Graph pad software Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocol for three-dimensional confocal morphometric analysis of astrocytes

Comme les cellules gliales dans le cerveau, les astrocytes ont divers rôles fonctionnels dans le système nerveux central. En présence de stimuli nocifs, les astrocytes modifier leurs propriétés fonctionnelles et structurales, une condition appelée astrogliose réactif. Ici, un protocole pour l&#39;évaluation des propriétés morphologiques des astrocytes est présenté. Ce protocole inclut la quantification des 12 paramètres différents à savoir la zone de surface et le volume du tissu couvert par un astrocyte (territoire des astrocytes), l&#39;ensemble des astrocytes notamment les branches, le corps de la cellule, et le noyau, ainsi que la longueur totale et le nombre de branches, l&#39;intensité de fluorescence immunoréactivité des anticorps utilisés pour la détection des astrocytes, des astrocytes et de la densité (nombre / 1000 um 2). A cet effet en trois dimensions (3D) des images microscopiques confocales ont été créés, et des logiciels d&#39;analyse d&#39;images 3D comme Volocity 6.3 a été utilisé pour les mesures. Les tissus du cerveau de rat exposés à la bêta-amyloïde 1-40 </sub&gt; (Aß 1-40), avec ou sans une intervention thérapeutique a été utilisé pour présenter la méthode. Ce protocole peut également être utilisé pour la 3D analyse morphométrique d&#39;autres cellules provenant soit in vivo soit in vitro dans des conditions.

Cette section présente quelques exemples des observations qualitatives et quantitatives produites par l&#39;analyse morphométrique 3D. Pour les résultats complets de l&#39;ensemble des 12 paramètres mentionnés plus tôt, s&#39;il vous plaît voir notre publication précédente 10. Observations qualitatives Les astrocytes exposées branches minces ou épaisses qui étaient généralement longtemps dans Aß 1-40 rats injectés (Fi...

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes at JoVE.com

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Protocole pour tridimensionnelle confocale Analyse morphométrique des astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

protocol-for-three-dimensional-confocal-morphometric-analysis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K vues.  Linköping University. Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Vidéo: Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the retinal ganglion cell layer (RGCL) in rat models with N-methyl-D-aspartate (NMDA)&#x2013;induced excitotoxicity1, retinal ischemia-reperfusion injury2 and glaucoma3. Reduction of INL and inner plexiform layer (IPL) thicknesses were reversed with citicoline treatment in rats' eyes subjected to kainic acid-mediated glutamate excitotoxicity4. Alteration of RGC density and soma sizes were observed with different drug treatments in eyes with elevated intraocular pressure3,5,6. Therefore, having objective methods of analyzing the retinal morphometries may be of great significance in evaluating retinal pathologies and the effectiveness of therapeutic strategies.
The retinal structure is multi-layers and several different kinds of neurons exist in the retina. The morphometric parameters of retina such as cell number, cell size and thickness of different layers are more complex than the cell culture system. Early on, these parameters can be detected using other commercial imaging software. The values are normally of relative value, and changing to the precise value may need further accurate calculation. Also, the tracing of the cell size and morphology may not be accurate and sensitive enough for statistic analysis, especially in the chronic glaucoma model. The measurements used in this protocol provided a more precise and easy way. And the absolute length of the line and size of the cell can be reported directly and easy to be copied to other files. For example, we traced the margin of the inner and outer most nuclei in the INL and formed a line then using the software to draw a 90 degree angle to measure the thickness. While without the help of the software, the line maybe oblique and the changing of retinal thickness may not be repeatable among individual observers. In addition, the number and density of RGCs can also be quantified. This protocol successfully decreases the variability in quantitating features of the retina, increases the sensitivity in detecting minimal changes.
 	This video will demonstrate three types of morphometric analyses of the retinal sections. They include measuring the INL thickness, quantifying the number of RGCs and measuring the sizes of RGCs in absolute value. These three analyses are carried out with Stereo Investigator (MBF Bioscience &mdash; MicroBrightField, Inc.). The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

This video demonstrates three types of morphometric analyses of the retina, which include measuring the inner nuclear layer thickness, quantifying the number of retinal ganglion cells (RGCs) and measuring the sizes of RGCs. The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

Analyses morphométriques des sections rétiniennes

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Recherche

Neurosciences

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

Dissection et de la culture de la souris dopaminergique et des explants striataux en trois dimensions dosages matrice de collagène

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualisation et la manipulation génétique des dendrites et des épines dans le cortex cérébral et l&#39;hippocampe de souris à l&#39;aide<em&gt; In utero</em&gt; Électroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that include expression of novel surface antigens and production of mediators that build up and maintain the inflammatory response. Emerging evidence indicates that M/M are highly plastic cells that can assume classic pro-inflammatory (M1) or alternative anti-inflammatory (M2) activation after acute brain injury. However a complete characterization of M/M phenotype marker expression, their colocalization and temporal evolution in the injured brain is still missing.	
	Immunofluorescence protocols specifically staining relevant markers of M/M activation can be performed in the ischemic brain. Here we present immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis as a powerful approach to investigate the pattern of localization and co-expression of M/M phenotype markers such as CD11b, CD68, Ym1, in mouse model of focal ischemia induced by permanent occlusion of the middle cerebral artery (pMCAO). Two-dimensional analysis of the stained area reveals that each marker is associated to a defined M/M morphology and has a given localization in the ischemic lesion. Patterns of M/M phenotype marker co-expression can be assessed by three-dimensional confocal imaging in the ischemic area. Images can be acquired over a defined volume (10 &mu;m z-axis and a 0.23 &mu;m step size, corresponding to a 180 x 135 x 10 &mu;m volume) with a sequential scanning mode to minimize bleed-through effects and avoid wavelength overlapping. Images are then processed to obtain three-dimensional renderings by means of Imaris software. Solid view of three dimensional renderings allows the definition of marker expression in clusters of cells. We show that M/M have the ability to differentiate towards a multitude of phenotypes, depending on the location in the lesion site and time after injury.

A way to gain new insights into the complexity of the brain inflammatory response is presented. We describe immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis to investigate the pattern of co-expression of microglia/macrophage phenotype markers in a mouse model of focal ischemia.

Trois dimensions d&#39;analyse confocale de marqueurs microglies / macrophages de polarisation dans Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Denver Papillae Protocol for Objective Analysis of Fungiform Papillae

The goal of the Denver Papillae Protocol is to use a dichotomous key to define and prioritize the characteristics of fungiform papillae (FP) to ensure consistent scoring between scorers. This protocol builds off of a need that has arisen from the last two decades of taste research using FP as a proxy for taste pore density. FP density has historically been analyzed using Miller &#38; Reedy&#8217;s 1990 characterizations of their morphology: round, stained lighter, large, and elevated. In this work, the authors forewarned that stricter definitions of FP morphology needed to be outlined. Despite this call to action, follow up literature has been scarce, with most studies continuing to cite Miller &#38; Reedy&#8217;s original work. Consequently, FP density reports have been highly variable and, combined with small sample sizes, may contribute to the discrepant conclusions on the role of FP in taste sensitivity. The Genetics of Taste Lab explored this apparent inconsistency in counting and found that scorers were individually prioritizing the importance of these characteristics differently and had no guidance for when a papilla had some, but not all, of the reported qualities of FP. The result of this subjectivity is highly variable FP counts of the same tongue image. The Denver Papillae Protocol has been developed to remedy this consequence through use of a dichotomous key that further defines and prioritizes the importance of the characteristics put forth by Miller &#38; Reedy. The proposed method could help create a standard way to quantify FP for researchers in the field of taste and nutritional studies.

Here we present a protocol to measure fungiform papilla density from digital photographs. This method builds prioritization and objective characteristic metrics into the original descriptive work on fungiform papillae by Miller &#38; Reedy (1990).

Denver Protocole Papilles pour analyse objective des papilles fongiformes

The goal of the Denver Papillae Protocol is to use a dichotomous key to define and prioritize the characteristics of fungiform papillae (FP) to ensure ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

Imagerie en trois dimensions et l’analyse des mitochondries dans les fibres nerveuses humaines intra-épidermiques

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

Culture In Vivo-comme les Astrocytes Murine en utilisant le protocole AWESAM rapide, Simple et peu coûteux

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Imagerie tridimensionnelle à grande échelle de l’organisation cellulaire dans le néocortex de souris

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. We have developed a software package for accurate and robust shape modeling and group-wise analysis. Here, we introduce an pipeline for the shape analysis, from individual 3D shape modeling to quantitative group shape analysis. We also describe the pre-processing and segmentation steps using open software packages. This practical guide would help researchers save time and effort in 3D shape analysis on brain structures.

We introduce a semi-automatic protocol for shape analysis on brain structures, including image segmentation using open software, and further group-wise shape analysis using an automated modeling package. Here, we demonstrate each step of the 3D shape analysis protocol with hippocampal segmentation from brain MR images.

Modélisation et analyse tridimensionnelles de la forme des structures cérébrales

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial organization of synaptic vesicles. In order to obtain high-quality electron micrographs that can yield the degree of morphological detail necessary for quantitative analysis of pre-synaptic vesicle distribution, optimal specimen preparation is critical. Chemical fixation is the first step in the process of specimen preparation, and of utmost importance to preserve fine ultrastructure. Vascular fixation with a glutaraldehyde-formaldehyde solution, followed by treatment of vibratome-sectioned specimens with osmium tetroxide, stabilizes the maximum number of molecules, especially proteins and lipids, and results in superior conservation of ultrastructure. Tissue is then processed with counterstaining, sequential dehydration and resin-embedding. En bloc staining with uranyl acetate (i.e., staining of vibratome-sectioned tissue before resin embedding) enhances endogenous contrast and stabilizes cell components against extraction during specimen processing. Contrast can be further increased by applying uranyl acetate as a post-stain on ultrathin sections. Double-staining of ultrathin sections with lead citrate after uranyl acetate treatment also improves image resolution, by intensifying electron-opacity of nucleic acid-containing structures through selective binding of lead to uranyl acetate. Transmission electron microscopy is a powerful tool for characterization of the morphological details of synaptic vesicles and quantification of their size and spatial organization in the terminal bouton. However, because it uses fixed tissue, transmission electron microscopy can only provide indirect information regarding living or evolving processes. Therefore, other techniques should be considered when the main objective is to study dynamic or functional aspects of synaptic vesicle trafficking and exocytosis.

We describe procedures for processing newborn rat brain tissue to obtain high-resolution electron micrographs for morphometric analysis of synaptic vesicle distribution at nerve terminals. The micrographs obtained with these methods can also be used to study the morphology of a number of other cellular components and their dimensional structural relationships.

Préparation du tissu cérébral nouveau-né du rat pour l’analyse morphométrique ultrastructurale de la distribution synaptique des vésicules aux terminaux nerveux