Cette méthode peut aider à classer les sous-types neuronaux et à étendre notre compréhension de la carte fonctionnelle des circuits corticals. Ce protocole a été optimisé pour préserver l’ultrastructure des neurones et obtenir une excellente récupération des tonnelles dendritiques et axonales, permettant des reconstructions de haute qualité. À la fin d’un enregistrement électrophysiologique, transférer la tranche contenant la cellule enregistrée dans un petit plat d’ACSF.
Tout en travaillant dans un capot de fumée, rouler la tranche sur un petit morceau de papier filtre de qualité fine et placer un autre morceau de papier filtre humidifié sur la tranche. Placer le tissu dans une petite casserole en plastique contenant de 5 à 10 millilitres de solution fixative et conserver à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, transférez le tissu du récipient avec la solution fixative à un récipient avec deux millilitres de tampon de phosphate molaire de 0,1 afin de rincer, et coupez n’importe quel tissu excédentaire avec une lame de scalpel.
Enlever l’excès de tissu en plaçant la tranche dans une boîte de Pétri, et couper l’excès de tissu avec une lame de scalpel. Transférer le tissu coupé dans une boîte de Pétri propre, en s’assurant qu’il se trouve à plat sans plis ou plis. Retirer l’excédent de tampon à l’aide d’un pinceau sec.
Couvrir le tissu d’une solution de gélatine chaude et placer la boîte de Pétri sur un bloc congelé pour refroidir rapidement la solution. Ensuite, déplacez le plat de gélatine à 4 degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes. Dans une hotte de fumée, utilisez une lame de scalpel pour découper un petit bloc de 1 X 1 centimètre contenant le tissu gélatineux incorporé.
Soulevez le bloc à l’aide d’une petite spatule et transférez soigneusement vers une solution fixative fraîche. Laisser fixer pendant au moins 30 minutes à quatre degrés Celsius. Après cette deuxième fixation, laver le bloc de gélatine en cinq millilitres de PB trois fois.
Après le lavage, séchez le bloc à l’aide d’un morceau de papier. Ensuite, utilisez une petite quantité de colle cyanoacrylate pour coller le bloc, orienté avec le tissu en haut, sur un camion vibratoire à l’aide de colle super. Sectionner la tranche à 50 microns d’épaisseur à l’aide d’un vibratome et placer soigneusement chaque section dans un flacon de verre contenant 10 pour cent de saccharose.
Après la section, ramasser soigneusement une section du flacon et la placer à plat dans un couvercle de boîte de Pétri. Ensuite, utilisez une lame de scalpel frais pour enlever la gélatine autour de la section. Placez les sections dans un flacon contenant 2 millilitres de saccharose frais de 10 pour cent dans PB, et agitez pendant 10 minutes pour commencer le processus de cryoprotection.
Après la cryoprotection, placer les sections à plat sur un petit rectangle de papier d’aluminium à l’aide d’un pinceau. Retirer tout excès de liquide des sections et plier délicatement le papier d’aluminium dans une parcelle. Maintenez la feuille d’aluminium près de la surface de l’azote liquide sans toucher la surface pendant 30 secondes.
Et puis laisser les sections décongeler complètement pendant environ 30 secondes. Répétez le gel décongeler encore deux fois. Retirez toutes les sections du papier d’aluminium à l’aide d’un pinceau et placez-les dans un flacon de verre contenant deux millilitres de PB pour laver l’excès de saccharose sous agitation constante.
Après immunostaining pour l’imagerie de fluorescence, placez la glissière dans une boîte en verre de Petri contenant PBS, et retirez soigneusement le glissement de couverture. Ensuite, lavez les sections de la lame à l’aide d’impulsions douces de PBS à partir d’une pipette Pasteur. Placez les sections dans un flacon de verre propre contenant du PBS.
Effectuez la réaction Avidin HRP en incubant d’abord les sections du complexe de biotine Avidin ou ABC, pendant au moins deux heures pour amplifier le produit de réaction HRP. Ensuite, lavez les sections avec PBS 3 fois pendant 10 minutes, puis avec le tampon tris deux fois pendant 10 minutes. Après avoir enlevé le dernier lavage tampon tris, ajoutez rapidement une goutte de huit pour cent de solution de chlorure de nickel à la solution de diaminobenzidine ou solution DAB.
Ensuite, pipette la solution dans et hors de mélanger et d’ajouter rapidement un millilitre de cette solution sur les sections. Incuber les sections de cette solution pendant 15 minutes. Ajoutez ensuite 10 microlitres de peroxyde d’hydrogène à 1 % à la solution DAB.
Laissez la réaction se poursuivre dans l’obscurité sous une agitation constante pendant environ une à deux minutes jusqu’à ce que les cellules soient étiquetées. Dans une hotte de fumée, placer un petit cercle de papier filtre dans une boîte de Pétri et l’humidifier avec PB. Soulevez les sections une à la fois du flacon de verre à l’aide d’un pinceau et placez-les soigneusement à plat sur le papier. Couvrez les sections d’un autre cercle humidifié de papier filtre et retirez l’excès de tampon en touchant doucement le papier de soie à la surface.
Appliquer huit ou neuf gouttes d’un pour cent de tétoxyde d’osmium dans PB sur le papier supérieur. Couvrir le plat et le conserver dans le capot des vapeurs pendant au moins 30 minutes, mais pas plus d’une heure. Après le rinçage, le montage et la couverture des sections, déshydrater à travers une série de 50 pour cent, 70 pour cent, 95 pour cent, et 100 pour cent des solutions d’alcool.
Après l’étape de déshydratation, transférer les sections dans un flacon de verre contenant 100 pour cent d’éthanol sur un shaker pendant environ cinq minutes. Remplacer la solution d’alcool par de l’oxyde de propylène et laver trois fois pendant cinq minutes. Après le dernier lavage, conserver environ deux millilitres d’oxyde de propylène dans le flacon et ajouter de la résine à un rapport de 1:1.
Assurez-vous que la résine est dissoute et gardez les sections sous agitation constante pendant 30 minutes. Après 30 minutes, utiliser un bâton en bois pour placer chaque section dans une planchette en aluminium contenant de la résine époxy, et incuber pendant la nuit. Le lendemain, déposer la planchette sur une plaque chaude pendant environ 10 minutes.
Ensuite, prenez chaque section avec un bâton en bois et placez-le sur une lame propre. Une fois que toutes les sections ont été transférées sur la diapositive, visualisez la diapositive sous un microscope disséquant pour vérifier l’orientation des tranches et placer un coverslip sur les sections. Guérir au four pendant 48 heures à 56 degrés Celsius.
Utilisez un objectif de grossissement faible pour vous concentrer sur la section d’accueil contenant le corps cellulaire. Ensuite, utilisez un objectif 100x, concentrez-vous sur le corps cellulaire, et cliquez au centre pour marquer le point de référence. Pour tracer le soma en 3D à l’aide de l’objectif 100x, sélectionnez le contour de l’onglet trace et sélectionnez le contour du corps cellulaire.
Utilisez le joystick pour déplacer la mise au point vers le haut du corps cellulaire. Placez les points en cliquant autour du périmètre de la pièce qui est actuellement au point. Cliquez à droite et sélectionnez le contour étroit pour terminer ce premier contour.
Répétez ce processus à différentes positions z jusqu’à ce que le fond du corps cellulaire soit atteint. Pour tracer la tonnelle dendritique, sélectionnez le dendrite ou le dendrite apical, dans le menu neurone. Tout d’abord, tracez un court segment initial pour chaque dendrite à l’aide de la roue de défilement de la souris pour ajuster le diamètre du curseur pour correspondre au diamètre du dendrite.
Tracez le long de chaque dendrite. Lorsqu’un nœud de l’arbre est atteint, cliquez à droite et sélectionnez le nœud bifurquant ou le nœud trifurquant du menu dropdown. Pour identifier les points correspondants entre les dendrites dans une section qui correspond à la section terminée, cliquez sur l’onglet déplacer et sélectionnez les points de correspondance.
Sélectionnez le nombre de points à apparier, puis appuyez sur OK. Cliquez sur la fin d’une branche terminée, puis cliquez sur la branche. Répétez cette demande pour chaque point de match. Une fois que tous les dendrites de chaque section ont été tracés, tracez l’axon en utilisant le même processus Montré ici est une reconstruction d’une cellule de panier CA2 avec arboration dendritique et axonale restreinte à l’aide d’un tube à dessin.
Les dendrites sont en noir et l’axon est en rouge. Il s’agit d’une image d’exemple de la cellule de panier remplie de biocytine suivant le protocole Avidin HRP décrit ici. Voici une vidéo d’une reconstruction neuronale 3D de la cellule de panier CA2.
Les dendrites sont en rose foncé et l’axon est en blanc. Enfin, cette image montre un dendrogram de la cellule panier CA2. Il faudra du temps pour devenir compétent avec ce protocole.
Cependant, cette approche optimisée peut générer des images à haute résolution de structures corticales et hippocampales complexes in vitro.
