Ce protocole permet de retracer efficacement les lignées cellulaires et les identités chez les embryons vivants tout en analysant simultanément des morphologies cellulaires détaillées telles que les axones et les dendrites dans le développement des neurones C.elegans. Par rapport à la microscopie confocale, la microscopie ou diSPIM d’éclairage sélectif inversé à double vue offre un signal plus élevé au bruit, une résolution spatiale plus isotropique et est mieux adaptée à l’imagerie in vivo à long terme. Commencez par ajouter 500 microlitres de solution de méthylcellulose à 1 % dans la dépression d’une lame de microscope concave.
À l’aide d’une pioche en fil de platine, transférer les adultes d’une plaque moyenne de croissance des nématodes vers la solution de méthylcellulose M9. Utilisez les pointes aiguisées des aiguilles hypodermiques de calibre 18 pour couper chaque animal transversalement au milieu du corps en au moins un à quatre embryons cellulaires. Avec un embout buccal aspirateur maintenu doucement entre les dents, préfillez une pipette microcapillaire avec 10 à 15 microlitres de tampon M9 et aspirez doucement plusieurs embryons de la glissade dans le capillaire.
Distribuez les embryons dans le rectangle central de la couverture d’une chambre d’imagerie en acier remplie de tampon M9 frais. Orientez doucement les embryons verticalement de sorte que le long axe de chaque embryon soit perpendiculaire au long axe du coverslip. Placez ensuite la chambre d’imagerie en acier dans le porte-échantillon sur la scène d’un diSPIM.
Pour préparer les embryons à l’imagerie, ouvrez le micro-gestionnaire et réglez les intensités laser à 179 microwatts 0,5% équivalence pour 488 nanomètres et 79 microwatts 0,25% équivalence pour 561 nanomètres. L’étalonnage entre l’ajustement logiciel et la sortie laser réelle doit être fait à l’avance afin de définir la portée de microwatts spécifiques. Dans le menu plugins, sélectionnez le contrôle de l’appareil et l’imagerie scientifique appliquée diSPIM pour ouvrir l’imagerie scientifique appliquée à double vue inversée fenêtre de microscopie d’éclairage sélectif du plan.
Sous l’onglet acquisition, confirmez que les paramètres sont définis comme indiqué. Sous l’onglet autofocus, définissez les paramètres comme indiqué. Notez que le canal d’autofocus doit spécifier le canal de fluorescence nucléaire pour les expériences de lineaging prévues.
Vérifiez le faisceau et les boîtes à feuilles pour le chemin A ou B et cliquez en direct pour commencer l’acquisition de l’image. Une fenêtre de vue en direct s’ouvrira. Dessinez ensuite une boîte autour de l’embryon d’intérêt pour sélectionner la région d’analyse autofocus de l’embryon et cliquez sur commencer l’acquisition pour lancer la capture d’image multidimensionnelle à long terme.
Pour la visualisation d’images, le traitement et l’analyse de la lignée cellulaire, après le téléchargement et l’extraction du paquet logiciel, cliquez deux fois sur le fichier jnlp CytoSHOW_app. pour commencer à exécuter CytoSHOW. Dans le menu du fichier, sélectionnez nouveau et diSPIM moniteur micro manager pour localiser le dossier de jeu de données racine où les images brutes micro manager ont été enregistrées.
Sélectionnez n’importe quel dossier de point de temps et cliquez sur ouvrir. Les fenêtres de navigation multidimensionnelles seront ouvertes automatiquement pour SPIM A et SPIM B.À l’aide de l’outil de sélection du polygone, cliquez juste à l’extérieur des bords antérieur, postérieur, dorsale et ventral de l’embryon d’intérêt pour générer un modèle de nœud papillon sur l’embryon dans les vues SPIM A et SPIM B et cliquez sur diSPIM. Alignez les canaux verts et rouges pour chaque bras SPIM et cliquez à nouveau sur diSPIM.
Les décalages seront déclenchés dans toutes les autres fenêtres de position. Ensuite, cliquez sur diSPIM et fusible pour ouvrir la boîte de dialogue de volumes de données brutes diSPIM fusible décontvolvée et définir les paramètres comme indiqué. Lorsque tous les paramètres ont été définis, cliquez sur oui et spécifiez le répertoire de sortie dans lequel enregistrer les fichiers traités avant de cliquer sur OK. Dans la fenêtre d’aperçu, déplacez la barre de défilement t vers le point de temps deux de la fenêtre et déplacez le z-slider jusqu’à ce que la vue directement le long du long axe de l’embryon soit affichée.
Déplacez la barre de défilement de t à l’heure point un dans la fenêtre d’aperçu et utilisez l’outil de sélection de ligne pour tracer une ligne du noyau ventral le plus rond par le plan des plaques de métaaphase de cellules AB. Cliquez sur le bouton d’aperçu diSPIM pour enregistrer les ajustements fins à l’orientation du volume d’image prévisualisé. Réglez les barres de défilement t des fenêtres de moniteur diSPIM aux points de temps de départ et de fin de la durée complète des images à traiter.
Ensuite, cliquez sur OK. Pour une analyse efficace et précise de la lignée cellulaire, il est essentiel d’obtenir une orientation ADL précise des volumes de données avant le traitement starry night. Pour ouvrir la série de traces de lignée Starry Night dans AceTree, ouvrez le fichier AceTree personnalisé fourni et sélectionnez le fichier de configuration ouvert pour localiser l’annuaire de sortie précédemment indiqué. Ouvrez le sous-foldeur fusible pour l’embryon d’intérêt et sélectionnez le fichier édité.
Ensuite, cliquez sur ouvrir et procéder à la visualisation de la lignée et l’édition comme décrit précédemment. Les protocoles optimisés n’induisent aucune phototoxicité détectable aux embryons tel qu’évalué au moment de l’éclosion et au moment lié aux étapes de développement. Utilisant ce protocole comme démontré, les cellules non identifiées dans cette protéine fluorescente verte transgénique exprimant la souche de nématode ont été déterminées pour correspondre aux neurones moteurs, à la cellule excrétrice de canal, et à deux cellules de muscle.
Les neurones identifiés ont été obliquement formés dès 360 minutes après fertilisation avec l’axe cellulaire plus long représentant l’axe suivant pour l’excroissance neurite. De 385 à 410 minutes après la fécondation, les neurites rmdd ont étendu environ six micromètres antérieurs des corps cellulaires. De 415 à 445 minutes après la fécondation, les deux neurites se sont étendus dorsalement dans et autour de l’anneau présomptif de nerf.
En moyenne, chaque neurite RMDD a étendu environ 11 micromètres du corps cellulaire avant d’atteindre synchronement son homologue contralatéral au sommet de l’anneau. Prises ensemble, ces données démontrent que les caractéristiques neuronales de développement pour les cellules identifiables simples peuvent être examinées, comparées et quantifiées à l’aide de ce protocole intégré. Il est important de se rappeler d’orienter les embryons verticalement afin que le long axe de chaque embryon soit perpendiculaire au long axe du coverslip.
En utilisant ce protocole, nous avons commencé à explorer le système nerveux embryonnaire naissant sous tous les angles. Par exemple, lors de la naissance cellulaire, de la migration et de la différenciation, de la formation de neurites, de l’excroissance et de la fasciculation.
