Questo protocollo consente di tracciare in modo efficiente le lignaggi cellulari e le identità negli embrioni vivi, analizzando contemporaneamente morfologie cellulari dettagliate come assoni e dendriti nello sviluppo di neuroni C.elegans. Rispetto alla microscopia confocale, la microscopia ad illuminazione selettiva invertibile a doppia vista o diSPIM offre un segnale più elevato al rumore, una risoluzione spaziale più isotropica ed è più adatto per l'imaging in vivo a lungo termine. Inizia aggiungendo 500 microlitri di soluzione di metilcellulosa all'1% nella depressione di uno scivolo al microscopio concavo.
Utilizzando un piccone di filo di platino, trasferire gli adulti da una piastra media di crescita del nematode nella soluzione di metilcellulosa M9. Utilizzare le punte affilate di aghi ipodermici calibro 18 per tagliare ogni animale trasversalmente al corpo medio ad almeno uno o quattro embrioni cellulari. Con un bocchino aspiratore tenuto delicatamente tra i denti, precompilare una pipetta microcapillare con da 10 a 15 microlitri di tampone M9 e aspirare delicatamente diversi embrioni dallo scivolo nel capillare.
Erogare gli embrioni nel rettangolo centrale del coverslip di una camera di imaging in acciaio riempita con tampone M9 fresco. Orientare delicatamente gli embrioni verticalmente in modo che l'asse lungo di ogni embrione sia perpendicolare al lungo asse del coverslip. Quindi posizionare la camera di imaging in acciaio nel supporto del campione sullo stadio di un diSPIM.
Per preparare gli embrioni per l'imaging, aprire micro manager e impostare le intensità laser su 179 microwatt 0,5% di equivalenza per 488 nanometri e 79 microwatt 0,25% di equivalenza per 561 nanometri. La calibrazione tra la regolazione del software e la vera uscita laser deve essere eseguita in anticipo al fine di impostare lo spazio per microwatt specifici. Nel menu plugin, selezionare il controllo del dispositivo e il diSPIM di imaging scientifico applicato per aprire la finestra di microscopia di illuminazione selettiva invertita a doppia visualizzazione per immagini scientifiche applicate.
Nella scheda acquisizione verificare che i parametri siano impostati come indicato. Nella scheda messa a fuoco automatica impostare i parametri come indicato. Si noti che il canale di messa a fuoco automatica deve specificare il canale di fluorescenza nucleare per gli esperimenti di lineatura pianificati.
Selezionare le caselle del fascio e del foglio per il tracciato A o B e fare clic dal vivo per iniziare l'acquisizione dell'immagine. Si aprirà una finestra di visualizzazione dal vivo. Quindi disegnare una casella intorno all'embrione di interesse per selezionare l'area di analisi autofocus dell'embrione e fare clic sull'acquisizione iniziale per avviare l'acquisizione di immagini multidimensionali a lungo termine.
Per la visualizzazione, l'elaborazione e l'analisi del lignaggio cellulare delle immagini, dopo aver scaricato ed estratto il bundle software, fare doppio clic sul file jnlp di CytoSHOW_app. per iniziare a eseguire CytoSHOW. Nel menu file selezionare micro manager monitor nuovo e diSPIM per individuare la cartella del set di dati radice in cui sono state salvate le immagini di micro manager non elaborati.
Selezionare una cartella del punto di tempo e fare clic su Apri. Le finestre di navigazione multidimensionali verranno aperte automaticamente sia per SPIM A che per SPIM B.Utilizzando lo strumento di selezione poligonale, fare clic appena fuori dai bordi anteriore, posteriore, dorsale e ventrale dell'embrione di interesse per generare un motivo di papillon sull'embrione sia nelle viste SPIM A che SPIM B e fare clic su diSPIM. Allineare i canali verde e rosso per ogni braccio SPIM e fare di nuovo clic su diSPIM.
I turni verranno attivati in tutte le altre finestre di posizione. Fate quindi clic su diSPIM e fuse per aprire la finestra di dialogo volumi di dati grezzi diSPIM fusibile deconvolta e impostare i parametri come indicato. Una volta impostati tutti i parametri, fare clic su sì e specificare la directory di output in cui salvare i file elaborati prima di fare clic su OK. Nella finestra di anteprima spostare la barra di scorrimento t sul punto di tempo due della finestra e spostare il dispositivo di scorrimento z fino a visualizzare la vista direttamente lungo l'asse lungo dell'embrione.
Spostare la barra di scorrimento t al punto di tempo uno nella finestra di anteprima e utilizzare lo strumento di selezione della linea per disegnare una linea dal nucleo ventrale più rotondo attraverso il piano delle piastre di metafase della cella AB. Fate clic sul pulsante di anteprima diSPIM per salvare le regolazioni precise sull'orientamento del volume dell'immagine visualizzato in anteprima. Impostare le barre di scorrimento t delle finestre del monitor diSPIM sui punti di tempo iniziale e finale dell'intero intervallo di immagini da elaborare.
Quindi fare clic su OK. Per un'analisi efficiente e accurata del lignaggio cellulare, è fondamentale ottenere un preciso orientamento ADL dei volumi di dati prima dell'elaborazione di Starry Night. Per aprire la serie di tracce di derivazione Notte stellata in AceTree, aprire il file AceTree personalizzato fornito e selezionare apri il file di configurazione per individuare la directory di output indicata in precedenza. Aprire la sottocartella fusibile per l'embrione di interesse e selezionare il file modificato.
Quindi fare clic su apri e procedere con la visualizzazione e la modifica del lignaggio come descritto in precedenza. I protocolli ottimizzati non inducono alcuna fototossicità rilevabile agli embrioni valutata dal momento della schiusa e dai tempi relativi alle pietre miliari dello sviluppo. Usando questo protocollo come dimostrato, le cellule non identificate in questa proteina fluorescente verde transgenica che esprime il ceppo nematode sono state determinate per corrispondere ai motoneuroni, alla cellula del canale escretore e a due cellule muscolari.
I neuroni identificati sono stati modellati obliquamente già 360 minuti dopo la fecondazione con l'asse cellulare più lungo che rappresenta l'asse successivo per la crescita della neurite. Da 385 a 410 minuti dopo la fecondazione, i neuriti RMDD hanno esteso circa sei micrometri anteriori dei corpi cellulari. Da 415 a 445 minuti dopo la fecondazione, entrambi i neuriti si estendevano dorsalmente all'interno e intorno all'anello nervoso presuntivo.
In media, ogni neurite RMDD si estendeva a circa 11 micrometri dal corpo cellulare prima di incontrare in modo sincrono la sua controparte controparte controlaterale all'apice dell'anello. Nel loro insieme, questi dati dimostrano che le caratteristiche dello sviluppo neuronale per singole cellule identificabili possono essere esaminate, confrontate e quantificate utilizzando questo protocollo integrato. È importante ricordare di orientare gli embrioni verticalmente in modo che l'asse lungo di ogni embrione sia perpendicolare al lungo asse del coverslip.
Usando questo protocollo, abbiamo iniziato a esplorare il nascente sistema nervoso embrionale da tutte le angolazioni. Ad esempio, durante la nascita cellulare, la migrazione e la differenziazione, la formazione di neurite, la crescita e la fascicolazione.
