Este protocolo permite o rastreamento eficiente de linhagens celulares e identidades em embriões vivos, ao mesmo tempo em que analisa morfologias celulares detalhadas, como axônios e dendritos no desenvolvimento de neurônios C.elegans. Em comparação com a microscopia confocal, microscopia de iluminação de plano seletiva de visão dupla ou diSPIM oferece maior sinal ao ruído, resolução espacial mais isotropica, e é mais adequado para imagens in vivo de longo prazo. Comece adicionando 500 microlitros de solução de 1%de metilcelulose na depressão de um slide de microscópio côncavo.
Usando uma picareta de fio de platina, transfira os adultos de uma placa média de crescimento nematoide para a solução de metilcelulose M9. Use as pontas afiadas de 18 agulhas hipodérmicas de calibre 18 para cortar cada animal transversalmente no corpo médio para pelo menos um a quatro embriões celulares. Com um bocal aspirador mantido suavemente entre os dentes, preenchia uma pipeta microcapilar com 10 a 15 microliters de tampão M9 e aspirar suavemente vários embriões do slide para o capilar.
Distribua os embriões no retângulo central da tampa de uma câmara de imagem de aço cheia de tampão M9 fresco. Oriente suavemente os embriões verticalmente para que o longo eixo de cada embrião seja perpendicular ao longo eixo da fenda. Em seguida, coloque a câmara de imagem de aço no suporte da amostra no estágio de um diSPIM.
Para preparar os embriões para imagem, abra o microgerencial e defina as intensidades de laser para 179 microwatts 0,5% de equivalência para 488 nanômetros e 79 microwatts 0,25% de equivalência para 561 nanômetros. A calibração entre o ajuste do software e a saída real do laser deve ser feita com antecedência, a fim de definir o escopo para microwatts específicos. No menu plugins, selecione o controle do dispositivo e aplique diSPIM de imagem científica para abrir a janela de microscopia de iluminação de plano de visão dupla invertida de imagem científica.
Na guia de aquisição, confirme se os parâmetros estão definidos como indicado. Sob a guia de foco automático, defina os parâmetros conforme indicado. Observe que o canal de foco automático deve especificar o canal de fluorescência nuclear para os experimentos de lineamento planejados.
Verifique as caixas de feixe e folha para o caminho A ou B e clique ao vivo para iniciar a aquisição da imagem. Uma janela de visualização ao vivo será aberta. Em seguida, desenhe uma caixa em torno do embrião de interesse para selecionar a região de análise de foco automático do embrião e clique em iniciar a captura de imagem multidimensional de longo prazo.
Para visualização de imagens, processamento e análise de linhagem celular, após baixar e extrair o pacote de software, clique duas vezes no arquivo CytoSHOW_app. jnlp para começar a executar CytoSHOW. No menu de arquivos, selecione o novo e diSPIM monitore micro gerenciador para localizar a pasta de conjunto de dados raiz onde as imagens brutas do micro gerenciador foram salvas.
Selecione qualquer pasta de ponto de tempo e clique em abrir. As janelas de navegação multidimensionais serão abertas automaticamente para SPIM A e SPIM B.Utilizando a ferramenta de seleção de polígonos, clique logo fora das bordas anterior, posterior, dorsal e ventral do embrião de interesse para gerar um padrão de gravata borboleta sobre o embrião nas visualizações SPIM A e SPIM B e clique em diSPIM. Alinhe os canais verde e vermelho para cada braço SPIM e clique novamente em diSPIM.
Os turnos serão acionados em todas as outras janelas de posição. Em seguida, clique em diSPIM e fusível para abrir a caixa de diálogo de volumes de dados brutos diSPIM e defina os parâmetros conforme indicado. Quando todos os parâmetros tiverem sido definidos, clique em sim e especifique o diretório de saída para salvar os arquivos processados antes de clicar em OK. Na janela de visualização, mova a barra de t-scroll para o ponto de tempo dois da janela e mova o controle deslizante z até que a visão diretamente ao longo do eixo longo do embrião seja mostrada.
Mova a barra de rolagem t de volta para o ponto de tempo um na janela de pré-visualização e use a ferramenta de seleção de linha para desenhar uma linha do núcleo mais redondo do ventral através do plano das placas de metafase da célula AB. Clique no botão de visualização diSPIM para salvar os ajustes finos na orientação do volume visualizado. Defina as barras de t-scroll das janelas do monitor diSPIM para os pontos de tempo de partida e término do período completo de imagens para processar.
Em seguida, clique em OK. Para uma análise eficiente e precisa da linhagem celular, é fundamental obter uma orientação ADL precisa dos volumes de dados antes do processamento da Noite Estrelada. Para abrir a série de rastreamento de linhagem Starry Night no AceTree, abra o arquivo AceTree personalizado fornecido e selecione abrir o arquivo de configuração para localizar o diretório de saída indicado anteriormente. Abra a subpasta do fusível para o embrião de interesse e selecione o arquivo editado.
Em seguida, clique em abrir e proceder com a visualização e edição de linhagem como descrito anteriormente. Protocolos otimizados não induzem qualquer fototoxicidade detectável aos embriões avaliados pelo tempo de eclosão e pelo tempo relacionado aos marcos do desenvolvimento. Usando este protocolo como demonstrado, as células não identificadas nesta proteína fluorescente verde transgênica expressando tensão nematoide foram determinadas a corresponder aos neurônios motores, à célula do canal excretório e a duas células musculares.
Os neurônios identificados foram obliquamente moldados logo aos 360 minutos após a fertilização com o eixo celular mais longo representando o eixo subsequente para o crescimento de neurite. De 385 a 410 minutos após a fertilização, os neurites RMDD estenderam aproximadamente seis micrômetros anteriores aos corpos celulares. De 415 a 445 minutos após a fertilização, ambos os neurites estenderam dorsais dentro e ao redor do anel nervoso presunçoso.
Em média, cada neurite RMDD se estendia aproximadamente 11 micrômetros do corpo celular antes de atingir sincronizadamente sua contraparte contralateral no ápice do anel. Juntos, esses dados demonstram que as características de desenvolvimento neuronal para células identificáveis únicas são capazes de serem examinadas, comparadas e quantificadas usando este protocolo integrado. É importante lembrar de orientar verticalmente os embriões para que o longo eixo de cada embrião seja perpendicular ao longo eixo da fenda.
Usando este protocolo, começamos a explorar o sistema nervoso embrionário nascente de todos os ângulos. Por exemplo, durante o nascimento celular, migração e diferenciação, formação de neurita, crescimento e fasciculação.
