L’auteur remercie profondément Dr Asako Sugimoto (Université de Tohoku) pour son exposé utile. wyIs251 était un don généreux de m. Kang Shen (Stanford University). mnIs17 a été fourni par la CCG, qui est financée par le NIH Bureau des programmes d’Infrastructure de recherche (P40 OD010440). Ce travail a été soutenu par la bourse JSPS KAKENHI #17 H 05010 et #16 H 06536 et Daiichi Sankyo foundation, Brain Science Foundation et la Fondation Naito.

1. préparation des échantillons <ol><li>générer un transgénique c. elegans souche d’intérêt à l’aide de méthodes transgéniques 18. Également obtenir des souches appropriées de la centre de génétique de Caenorhabditis (CCG). Pour visualiser le transport axonal des précurseurs de la vésicule synaptique, utiliser la lignée transgénique wyIs251 [Pmig-13::gfp::rab-3] 7. Pour observer l’IFT, obtenir la lignée transgénique mnIs17 [osm-6::gfp] 19. Ces souches sont utilisés dans le présent protocole. 
	Remarque : Soit tableau extrachromosomique, intégration génomique ou même GFP knock-in œuvres. Pour réduire les signaux de fond, utilisez promoteurs de cellules spécifiques, plutôt que de promoteurs pan-neuronale. 
	NOTE : Entretien de worms est décrite dans les autres protocoles 20. Les souches ont été maintenus sur les pelouses de Escherischia coli OP50 amenée sur la croissance des nématode des plaques (NGM) moyennes (agarose de 1,7 % (p/v), 50 mM NaCl peptone de 0,25 % (p/v), 1 mM CaCl 2, cholestérol 5 mg/mL, 25 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgSO 4 boîtes en plastique de diamètre 60 mm) à 20 ° C.</li>
	<li>Grow worms à 20 ° C sur les plaques de NGM à n’importe quel stade du cycle de vie vers. 
	Remarque : On peut observer aussi bien le transport axonal et IFT à n’importe quel stade. Fin L4 à jeune adulte est un bon témoin positif parce que plusieurs publications ont utilisé ces étapes et visualisées traite des événements 14 , 21 , 22 , 23.</li>
</ol> 2. Préparation de 10 % Agarose Remarque : de nombreux fournisseurs offrent des produits similaires tels qu’agar, poudre d’agar et d’agarose. Utilisation de l’électrophorèse sur agarose de grade (résistance de gel &#62; 1200 g/cm 2). Poudres de gélose à bas prix ne fonctionnent pas car le gel qui en résulte n’est pas assez fort pour immobiliser vers.
<ol><li>Mix 0,4 g d’agarose dans 4 mL l’eau distillée (DW) dans un tube de verre (1,5 cm x 10,5 cm). Mettez un couvercle sur le tube de verre pour éviter l’évaporation.</li>
	<li>Mettre le tube en verre sur un bloc de chaleur de 95 ° C pendant 90 min. En outre, préparer un autre tube de verre (1,5 cm x 10,5 cm) rempli de DW et gardez-le à 95 ° C. mettre une pipette Pasteur dans le 95 ° C DW ( Figure 1 A). Beaucoup de petites bulles apparaîtront dans le tube de gel d’agarose et la solution doit être trouble. Laissez-le jusqu'à ce que la solution devienne claire. Ensuite, mélanger en pipettant également de haut en bas jusqu'à ce que la solution d’agarose devient homogène. 
	Remarque : Les micro-ondes ne peut servir à préparer la solution à 10 % d’agarose lors de DW et d’agarose. Petites bulles causées par micro-ondes empêchent d’agarose fonte. Cependant, solidifié 10 % gel d’agarose peut facilement faire fondre à nouveau en utilisant un four micro-ondes. Tubes de verre contenant du gel d’agarose de 10 % peuvent être préparés à l’avance et conservés à 4 ° C pendant au moins 6 mois. Si, ce faisant, faire fondre le stock à l’aide d’un four à micro-ondes lorsque nécessaire et commencez à l’étape 3 dans le présent protocole. 
	NOTE : Agarose perd progressivement la capacité de solidifier si incubés à 95 ° C pendant une longue période ou après répétées de solidification et de fusion. Dans ce cas, préparer les nouveaux 10 % d’agarose.</li>
</ol> 3. Préparation du gel d’Agarose Pad <ol><li>à l’aide de la pipette Pasteur chaude préparée à l’étape 2.2, déposer 2 gouttes d’agarose de 10 % sur une lame de 76 x 22 mm.</li>
	<li>Rapidement couvrir avec une deuxième diapositive 2 de 76 x 22 mm avant la chute de l’agarose se solidifie comme montré dans la Figure 1 B et poussez vers le bas sur la deuxième diapositive pour aplatir la solution de gel d’agarose. L’épaisseur doit être de 0,5 à 1 mm.</li>
	<li>Rapidement pour rincer la pipette Pasteur pipetage 95ºC DW monte et descend jusqu'à ce que la solution de gel d’agarose est délavée. Dans le cas contraire, la pipette va se bouchent en gel d’agarose. Laisser les commandes de la pipette dans le 95 ° C DW.</li>
	<li>Attendre pendant 1 min. Le coussin de gel d’agarose forme et devient trouble. Ensuite, glissez les lames apart à la main ( Figure 1 C).</li>
</ol> 4. Montage de Worms Remarque : même de petites quantités de mouvement ver empêchent bonne observation. Lévamisole a été utilisé traditionnellement pour empêcher tout mouvement de la vis sans fin sur l’agarose pad 24 , 25. Cependant, Levamisole inhibe les récepteurs neuronaux chez c. elegans et donc susceptibles d’affecter les événements trafic dans les neurones 15. À l’aide de microbilles de polystyrène décrit encore une bonne alternative 17.
<ol><li>Sous un microscope stéréo avec une transillumination miroir coulissant, transfert ~ 30 vers transgéniques exprimant les marqueurs appropriées pour une nouvelle NGM plaque sans prendre de bactéries à l’aide d’un fil de platine. 
	Remarque : Un choix de fil de platine est fait de fil de platine et pipette Pasteur (5 pouces), et l’extrémité du fil platine a été aplatie. La préparation des sélections de fil de platine et la manipulation de worms avec ces sont décrites dans le Wormbook (http://www.wormbook.org).</li>
	<li>Laisser la plaque pendant 1 min. bactéries sont automatiquement supprimés des surfaces vers comme les vers se déplacent sur gel d’agarose NGM sans bactéries.</li>
	<li>Put a 0,5 à 1,0 µL baisse de 2,6 % 100 nm de diamètre polystyrène microbilles dans l’eau sur le bloc de gélose ( Figure 1 D). Transfert vers 10-20 de la plaque NGM sans bactéries pour les microbilles. Drop et propagation les vers en utilisant le fil de platine choisir pour éviter le chevauchement des organes ( Figure 1 E) à vis sans fin.</li>
	<li>Appliquer une lamelle de 2 22 x 40 mm ( Figure 1 F). Pousser doucement pour enlever les bulles d’air, mais éviter les vers de concasseuse. L’échantillon est maintenant prêt pour l’imagerie. 
	NOTE : Parce qu’aucune anesthésie n’est administré, worms sont fixés uniquement par la force de frottement générée par le bloc de gélose, microbilles de polystyrène et lamelle 17. La présence de bactéries chargeur et/ou trop solution fera la force de frottement plus faible. 
	NOTE : Différentes tailles de lamelles couvre-objet (p. ex., 22 x 22 mm 2, 18 x 18 mm 2) fonctionnent. Cependant, les plus grandes lamelles couvre-objet peut empêcher immersion eau ou huile de la lentille de l’objectif une fuite dans les échantillons lors de l’observation.</li>
</ol> 5. Observation Remarque : les paramètres appropriés d’imagerie (puissance du laser, gain, binning, etc.) seront différente pour chaque système de microscope et de la caméra. Microscope widefield équipé d’un scanner confocal de disque de filature et de la caméra CCD est utilisé ici,.
<ol><li>Définir le contrôle de la température de l’étape à 20 ° C, ou régler la température ambiante de 20 ° C.</li>
	<li>Mettre la lame de l’échantillon sur la platine du microscope. Utilisez x 100 (ouverture numérique = 1.3 ou supérieur) objectif.</li>
	<li>Recherchez les zones indiquées en Figure 2 A (pour wyIs251 et transport axonal) ou Figure 2 B (pour mnIs17 et IFT) comme témoins positifs . Autres domaines peuvent être analysés comme bien 22.</li>
	<li>Jeu de paramètres (Gain CCD = 200, Binning = 1 ou 2, puissance du laser à 488 nm = 1,0 à 1,3 mW). Effectuer l’enregistrement lapse de temps à 4 images/s pour jusqu'à 1 min. enregistrer les fichiers en format TIFF mutli. 
	Remarque : Si GFP signale disparaissent et il est difficile de continuer à observer GFP::RAB-3 ou OSM-6::GFP pour 30 s, la puissance du laser est trop forte. Dans ce cas, réduire la puissance du laser. À l’inverse, si aucun mouvement vésiculaire n’est enregistré, la puissance du laser est trop faible. Dans ce cas, augmenter la puissance du laser.</li>
	<li>Consultez un autre ver et recommencez 5.3 et 5.4. Les observations peuvent durer jusqu'à 20 min, mais chaque ver devrait être enregistrée qu’une seule fois pour éviter les effets de la photo dommage. 
	Remarque : Les vers ont été observées pendant au moins 20 min sans défauts significatifs 7 , 27 , 28. Observation plus longue peut être possible, mais le havre &#39; t été encore testé. Un signe clair de la mort neuronale est le changement de morphologie neuronale comme gonflement des neurites. Comme les signaux faibles de GFP peuvent être vu dans les axones et les dendrites en wyIs251 et en mnIs17, les neurites morphologie peut être facilement vérifiée en regardant juste les axones ou dendrites. La morphologie neuronale est illustrée à la Figure 2.</li>
	<li>Générer des fichiers de film.
	<ol><li>Ouvert le Multi-TIFF fichier à l’aide de logiciels de Fidji. Allez dans fichier &#62; accéder puis sélectionner le fichier Multi-TIFF enregistré à l’étape 5.4. 
		Remarque : Les Fidji peut être téléchargé à jttps://fiji.sc. Image J et plugins peuvent aussi servir pour générer kymographs. Si ce faisant, suivez les instructions pertinentes pour le plugin choisie.</li> <li>cliquez le &#34; sélection rectangulaire &#34; bouton ( Figure 3 A, flèche) et sélectionnez la zone d’intérêt en dessinant un rectangle avec une souris d’ordinateur (rectangle jaune dans la Figure 3 A). Allez dans Image &#62; piles &#62; outils &#62; faire la Revolution, puis sélectionnez le nombre de tranches qui est inclus dans le film. Un substack est généré.</li>
		<li>Activer la fenêtre de substack en cliquant et allez dans Image &#62; Adjust &#62; luminosité/contraste. Une fenêtre pour ajuster la luminosité et le contraste apparaît. Dans la fenêtre, faites glisser le haut bar (Minimum) vers la droite afin que le signal de fond disparaît et le second top bar (Maximum) vers la gauche alors que les vésicules et les particules mobiles peuvent être vu très bien sur le fond.</li>
		<li>Allez dans Image &#62; piles &#62; temps Stamper. Le film est enregistré à 4 images/s à l’étape 5.4, l’intervalle de temps est de 0,25 s. Ainsi, tapez &#34; 0,25 &#34; dans l’intervalle.</li>
		<li>Génère un fichier de séquence en sélectionnant enregistrer sous &#62; AVI dans le menu fichier (film 1 et 2). 
		Remarque : En utilisant des plugins appropriés, vous pouvez enregistrer le fichier sous d’autres formats tels que &#34; mpeg4 &#34; ou &#34; mov &#34; fichiers.</li>
	</ol></li> <li>Générer kymographs.
	<ol><li>Ouvrir les fichiers de film original à l’aide de logiciels de Fidji à nouveau et répéter les étapes 5.6.2 et 5.6.3 pour ajuster la luminosité et le contraste.</li>
		<li>Click &#34; segments de ligne &#34; ( Figure 3 B, flèche). À l’aide d’une souris, tracez une ligne segmentée le long des cils ou axon (ligne jaune, à la Figure 3 B).</li>
		<li>Aller à analyser &#62; kymographes Multi &#62; Multi kymographes ( Figure 3 C). Ligne largeur fenêtre s’affiche ( Figure 3 D). Type &#34; 3 &#34; dans la fenêtre largeur de raie et cliquez sur OK ( Figure 3 D).</li>
		<li>Kymographes fenêtre est créée. Enregistrer l’image au format TIFF ou JPEG.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WD+repeat-containing+protein+IFTA-1+is+required+for+retrograde+intraflagellar+transport.">The WD repeat-containing protein IFTA-1 is required for retrograde intraflagellar transport.</a> Mol Biol Cell. 17 (12), 5053-5062 (2006).</li><li>Evans, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+modulation+of+IFT+kinesins+extends+the+sensory+repertoire+of+ciliated+neurons+in+Caenorhabditis+elegans.">Functional modulation of IFT kinesins extends the sensory repertoire of ciliated neurons in Caenorhabditis elegans.</a> J Cell Biol. 172 (5), 663-669 (2006).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+differentiation+of+cooperating+kinesin-2+motors+orchestrates+cargo+import+and+transport+in+C.+elegans+cilia.">Functional differentiation of cooperating kinesin-2 motors orchestrates cargo import and transport in C. elegans cilia.</a> Nat Cell Biol. 17 (12), 1536-1545 (2015).</li><li>Robison, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detyrosinated+microtubules+buckle+and+bear+load+in+contracting+cardiomyocytes.">Detyrosinated microtubules buckle and bear load in contracting cardiomyocytes.</a> Science. 352 (6284), 0659 (2016).</li><li>Hayashi, S., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+superresolution+fluorescence+imaging+with+spinning+disk+confocal+microscope+optics.">Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics.</a> Mol Biol Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).</li></ol>

L’auteur n’a rien à divulguer.

Limitation en ce qui concerne les méthodes existantes La méthode décrite ici est optimisée afin d’observer les événements rapides tels que le transport axonal et IFT. Ainsi, immobilisation est plus prioritaire que d’incubation plus longue. Alors que nous avons pu observer les événements trafic pendant au moins 20 min sans perturbation significative, cette méthode peut ne pas convenir toujours d’observer les événements lentes nécessitant des observations plus longues, telles que l’a...

L’imagerie de cellules vivantes est un outil essentiel pour l’analyse de transport intracellulaire. En biologie cellulaire neuronale, analyses du transport axonal avec l’imagerie de cellules vivantes sont essentielles pour comprendre la fonction et la morphogenèse neuronale1. Défauts dans le transport axonal sous-tendent plusieurs de troubles neurodégénératifs2. Kinésine superfamille des protéines et dynéine effectuer le transport axonal axonales et marqués, respectivement1,2.
Cils sont un autre compartiment cellulaire dans lequel le réseau de microtubules et traite des machines sont très développés3. Machinerie de synthèse de protéine n’est pas localisée dans les cils, ce qui signifie que les protéines ciliaires doivent être transportées du cytoplasme vers la pointe des cils. Kinésine propres cils et dynein, appelés kinésine-2 et cytoplasmiques dynéine-2, respectivement, transporter les composants de cils4, dans un phénomène appelé intraflagellaire transport (IFT)5. Dépréciation d’IFT provoque un éventail de maladies appelées ciliopathies6. Ainsi, l’analyse du mécanisme de l’imagerie de cellules vivantes IFT est nécessaire pour comprendre les mécanismes fondamentaux de la formation ciliaire et la pathogenèse.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) est un bon modèle pour étudier le transport axonal et IFT7,8,9. Pour observer l’IFT, Chlamydomonas a été largement utilisé comme un modèle organisme5,6. Comme Chlamydomonas est un organisme unicellulaire, la relation entre IFT et vieillissement, la fonction neuronale et comportement serait difficile à analyser. En outre, des techniques génétiques indispensables tels que CRISPR/Cas9 n’ont pas été appliquées de Chlamydomonas. Chez les organismes supérieurs de modèle, tels que souris et Drosophila, perturbation du transport axonal et IFT souvent provoque des phénotypes létales car transport axonal et IFT sont essentielles pour la morphogenèse et l’homéostasie des animaux 10, 11. Dans le cas de souris, transfection et culture cellulaire est généralement nécessaire d’observer le transport axonal et IFT, qui exige de nombreuses compétences et beaucoup de temps12,13. En outre, beaucoup de contexte physiologique important peut être perdue dans des cellules cultivées et des lignées cellulaires. Parce que le système nerveux n’est pas essentiel à la survie vers, c. elegans mutants dans lequel le transport axonal ou IFT sont perturbées ne sont souvent pas létales7,9,14. Le transport axonal et IFT peuvent être directement observé in vivo sans dissection parce que c. elegans est transparent et il est donc facile d’observer des marqueurs GFP-étiquetée.
Il existe plusieurs protocoles pour immobiliser c. elegans, comme l’utilisation d’un dispositif de microfluidique15, coussinets de gel d’agarose avec anesthésie16ou microbilles17. L’inclusion de l’anesthésie peut inhiber les événements trafic dans les neurones15. Un inconvénient évident de la méthode de dispositif microfluidique est que préparer un dispositif microfluidique n’est pas toujours facile. Au lieu de cela, immobilisation par coussinets de gel d’agarose et microbilles est un moyen pratique et facile d’effectuer l’imagerie de laps de temps chez c. elegans. Ici, je décris ce protocole de base pour immobiliser le c. elegans et visualiser le transport axonal et IFT in vivo dans c. elegans. Par rapport aux autres méthodes, la méthode décrite ici ne nécessite pas d’équipement spécial et est beaucoup moins cher et plus facile à réaliser.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="837">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Slideglass (76&#160; x 26 mm)</td>
			<td style="width:167px;">Matsunami</td>
			<td style="width:139px;">S1111</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Coverglass (22&#160; x 40 mm)</td>
			<td style="width:167px;">Matsunami</td>
			<td style="width:139px;">C024401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Agarose</td>
			<td style="width:167px;">Wako</td>
			<td style="width:139px;">318-01195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Polystylene microbeads 0.1 micron</td>
			<td style="width:167px;">Polysciences</td>
			<td style="width:139px;">#00876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Heat block</td>
			<td style="width:167px;">TAITEC</td>
			<td style="width:139px;">0063288-000</td>
			<td>CTU-mini</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Microscope</td>
			<td style="width:167px;">Olympus</td>
			<td style="width:139px;">IX-71</td>
			<td>widefield microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Spinning disk Scanner</td>
			<td style="width:167px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:139px;">CSU-X1</td>
			<td>spinning disc confocal scanner&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Digital CCD camera</td>
			<td style="width:167px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:139px;">C10600-10B</td>
			<td>ORCA-R2 degital CCD camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Objective lens (x100, NA1.4)</td>
			<td style="width:167px;">Olympus</td>
			<td style="width:139px;">UPLSAPO 100XO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Pasteur pipette (5 inch)</td>
			<td style="width:167px;">IWAKI</td>
			<td style="width:139px;">IK-PAS-5P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm)</td>
			<td style="width:167px;">IWAKI</td>
			<td style="width:139px;">9820TST15-105NP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">TV9211: wyIs251</td>
			<td style="width:167px;">Laboratory of Kang Shen</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">OTL11: mnIs17</td>
			<td style="width:167px;">Ref. 27, 29</td>
			<td style="width:139px;">N/A</td>
			<td>SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:167px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:139px;">435064-9000-000</td>
			<td>STEMI 508&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Mirror transillumination unit</td>
			<td style="width:167px;">Carl Zeiss</td>
			<td>435425-9010-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">platinum wire (0.2 mm)</td>
			<td style="width:167px;">Nilaco Corporation</td>
			<td style="width:139px;">m78483501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 mm plastic dish</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:139px;">#351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Fiji</td>
			<td style="width:167px;">N/A</td>
			<td style="width:139px;">N/A</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">nematode growth medium (NGM)&#160;&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immobilization of caenorhabditis elegans to analyze intracellular transport in neurons

Transport axonal et transport de (IFT) sont essentiels pour la fonction et morphogenèse axone et les cils. Dynéine et kinésine superfamille des protéines sont des moteurs moléculaires qui régulent antérograde et rétrograde transport, respectivement. Ces moteurs utilisent des réseaux de microtubules comme rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) est un organisme modèle puissant pour étudier le transport axonal et IFT in vivo. Ici, je décris un protocole afin d’observer le transport axonal et IFT vie c. elegans. Marchandises transportées peut être visualisé par marquage des protéines de cargaison à l’aide de protéines fluorescentes comme protéine fluorescente verte (GFP). C. elegans est transparent et protéines GFP-étiquetée de cargaison peuvent être exprimés dans des cellules spécifiques en vertu de promoteurs spécifiques des cellules. Vers vivants peuvent être résolus en microbilles sur gel d’agarose 10 % sans tuer ou anesthésier les vers. Dans ces conditions, mouvement de la cargaison peut être directement observé dans les axones et les cils de la vie c. elegans sans dissection. Cette méthode peut être appliquée à l’observation de n’importe quelle molécule de fret dans toutes les cellules en modifiant les protéines cibles et/ou les ils sont exprimés dans les cellules. Les protéines plus basiques tels que les moteurs moléculaires et protéines d’adaptateur qui sont impliqués dans le transport axonal et IFT sont conservés chez c. elegans. Par rapport aux autres organismes modèles, mutants peuvent être obtenus et maintenus plus facilement chez c. elegans. La combinaison de cette méthode avec divers mutants de c. elegans peut clarifier les mécanismes moléculaires du transport axonal et IFT.

Transport axonal dans le neurone AD9 En utilisant la ligne de wyIs251 , les antérograde et rétrograde transport axonal de GFP::RAB-3 peut être enregistrée simultanément dans le motoneurone AD9. La vitesse moyenne d’antérograde et rétrograde transport dans l’axone proximale dorsale du neurone AD9 est environ 1.8 et 2,6 μm/s, respectivement22. Le nombre de vésicules mobiles est environ 0,03 et 0,018 par μm d’axone par s. A...

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Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) est un bon modèle pour étudier le transport axonal et intracellulaire. Ici, je décris un protocole in vivo d’enregistrement et d’analyse du transport axonal et de chez c. elegans.

Immobilisation Caenorhabditis elegans , à analyser le Transport intracellulaire dans les neurones

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

The overall goal of this time lapse recording is to observe the intracellular transport events in Caenorhabditis elegans neurons.This method can help answer key questions in the cell biology field such as axonal transport and interflagellar transport.The main advantage of this technique is that one can observe intracellular transport in C.Elegans without dissection.Start this experiment by growing transgenic C.elegans strain of interest at 20

immobilization-caenorhabditis-elegans-to-analyze-intracellular

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

7.9K vues.  Tohoku University. The overall goal of this time lapse recording is to observe the intracellular transport events in Caenorhabditis elegans neurons.This method can help answer key questions in the cell biology field such as axonal transport and interflagellar transport.The main advantage of this technique is that one can observe intracellular transport in C.Elegans without dissection.Start this experiment by growing transgenic C.elegans strain of interest at 20

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Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Évaluation complète de la lignée germinale toxicité chimique Utilisation du nématode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Recherche

Biologie du développement

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple cellular and developmental processes principally via activation of ERK, the terminal kinase of the pathway. Tight regulation of ERK activity is essential for normal development and homeostasis; overly active ERK results in excessive cellular proliferation, while underactive ERK causes cell death. C. elegans is a powerful model system that has helped characterize the function and regulation of RTK-RAS-ERK signaling pathway during development. In particular, the RTK-RAS-ERK pathway is essential for C. elegans germline development, which is the focus of this method. Using antibodies specific to the active, diphosphorylated form of ERK (dpERK), the stereotypical localization pattern can be visualized within the germline. Because this pattern is both spatially and temporally controlled, the ability to reproducibly assay dpERK is useful to identify regulators of the pathway that affect dpERK signal duration and amplitude and thus germline development. Here we demonstrate how to successfully dissect, stain, and image dpERK within the C. elegans gonad. This method can be adapted for spatial localization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided an antibody compatible with immunofluorescence is available.

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

We present an immunofluorescence&#160;imaging-based method for spatial and temporal localization of active ERK in the dissected C. elegans gonad. The protocol described here can be adapted for visualization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided a suitable antibody reagent is available.

Analyse spatiale et temporelle d&#39;Active ERK dans le<em&gt; C. elegans</em&gt; germinale

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods are described here to analyze distinct populations of MTs in the developing neural tube of the zebrafish embryo. While the focus is on neural tissue, this methodology is broadly applicable to other tissues. The procedures are optimized for early to mid-somitogenesis-stage embryos (1 somite to 12 somites), however they can be adapted to a range of other stages with relatively minor adjustments. The first protocol provides a method to assess the spatial distribution of stable and dynamic MTs and perform a quantitative analysis of these populations with image-processing software. This approach complements existing tools to image microtubule dynamics and distribution in real-time, using transgenic lines or transient expression of tagged constructs. Indeed, such tools are very useful, however they do not readily distinguish between dynamic and stable MTs. The ability to image and analyze these distinct microtubule populations has important implications for understanding mechanisms underlying cell polarization and morphogenesis. The second protocol outlines a technique to analyze nascent MTs specifically. This is accomplished by capturing the de novo growth properties of MTs over time, following microtubule depolymerization with the drug nocodazole and a recovery period after drug washout. This technique has not yet been applied to the study of MTs in zebrafish embryos, but is a valuable assay for investigating the in vivo function of proteins implicated in microtubule assembly.

Immunolabeling methods to analyze distinct populations of microtubules in the developing zebrafish brain are described here, which are broadly applicable to other tissues. The first protocol outlines an optimized method for immunolabeling stable and dynamic microtubules. The second protocol provides a method to image and quantify nascent microtubules specifically.

Utilisation d’immunomarquage pour analyser des Microtubules stables et dynamiques naissants dans l’embryon de poisson zèbre

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissection et immunofluorescence souillant de champignon corps et photorécepteur de neurones dans le cerveau adulte Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

Application de RNAi et Expression du facteur de Transcription induite par la chaleur-choc pour reprogrammer les cellules germinales de neurones chez c. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are facilitated by the transparency of the animal, the ability to do forward and reverse genetic assays, the relative ease of generating fluorescently labeled proteins, and the use of fluorescent dyes that can either be microinjected into the early embryo or incorporated into its food (E. coli strain OP50) to label cellular organelles (e.g. 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1&#39;H-2,2&#39;-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Here, we present the use of a fluorescent pH-sensitive dye that stains intestinal lysosomes, providing a visual readout of dynamic, physiological changes in lysosomal acidity in live worms. This protocol does not measure lysosomal pH, but rather aims to establish a reliable method of assessing physiological relevant variations in lysosomal acidity. cDCFDA is a cell-permeant compound that is converted to the fluorescent fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein (cDCF) upon hydrolysis by intracellular esterases. Protonation inside lysosomes traps cDCF in these organelles, where it accumulates. Due to its low pKa of 4.8, this dye has been used as a pH sensor in yeast. Here we describe the use of cDCFDA as a food supplement to assess the acidity of intestinal lysosomes in C. elegans. This technique allows for the detection of alkalinizing lysosomes in live animals, and has a broad range of experimental applications including studies on aging, autophagy, and lysosomal biogenesis.

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

A step-by-step guide to probe loss of lysosomal acidity in the intestine of C. elegans using the pH-sensitive vital dye 5(6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)

Évaluer l’alcalinisation Lysosomal dans l' intestin de vivre Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Analyse de calcul de la lignée germinale de Caenorhabditis elegans pour étudier la Distribution des noyaux, les protéines et le cytosquelette

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.

Étudier le Stress oxydatif causé par les streptocoques de groupe Mitis chez Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

Microscopie isotrope en feuilles légères et analyse automatisée de la lignée cellulaire au catalogue Caenorhabditis elegans embryogenèse avec résolution subcellulaire

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female reproductive tract. While in vitro studies suggest that sperm of internally fertilizing animals can respond to various cues from their surroundings, the inability to visualize their behavior inside the female reproductive tract creates a challenge for understanding sperm migration and mobility in its native environment. Here, we describe a method using C. elegans that overcomes this limitation and takes advantage of their transparent epidermis. C. elegans males stained with a mitochondrial&#160; dye are mated with adult hermaphrodites, which act as modified females, and deposit fluorescently labeled sperm into the hermaphrodite uterus. The migration and motility of the labeled sperm can then be directly tracked using an epi-fluorescence microscope in a live hermaphrodite. In wild-type animals, approximately 90% of the labeled sperm crawl through the uterus and reach the fertilization site, or spermatheca. Images of the uterus can be taken 1 h after mating to assess the distribution of the sperm within the uterus and the percentage of sperm that have reached the spermatheca. Alternatively, time-lapse images can be taken immediately after mating to assess sperm speed, directional velocity and reversal frequency. This method can be combined with other genetic and molecular tools available for the C.elegans to identify novel genetic and molecular mechanisms that are important in regulating sperm guidance and motility within the female reproductive tract.

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Sperm must successfully navigate through the oviduct to fertilize an oocyte. Here, we describe an assay for measuring sperm migration within the C. elegans hermaphrodite uterus. This assay can provide quantitative data on sperm distribution within the uterus after mating, as well as on speed, directional velocity, and reversal frequency.

Mesure du sperme guidage et motilité dans le Caenorhabditis elegans hermaphrodite appareil de reproduction

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...