Avec cette méthode, nous pouvons étudier les effets de l’activité intrinsèque sur la maturation des précurseurs corticals d’interneuron. Cette technique fournit un moyen efficace de cibler et de manipuler les propriétés cellulaires des progéniteurs d’interneurones corticales qui est accessible à la majorité de la communauté scientifique. Ce protocole implique le traitement méticuleux des échantillons et de l’équipement, et il peut être apprécié par la démonstration visuelle.
À l’aide d’un stylo étanche, tracez une ligne droite au milieu de la partie inférieure de la surface inférieure de six boîtes de Pétri de 35 millimètres. Ajouter 10 millilitres de liquide 4% faible gelling agarose dans PBS dans deux des boîtes de 35 millimètres Petri et intégrer trois à quatre cerveaux disséqués dans l’agarose avec les ampoules olfactives orientées vers le bas par plat à travers la ligne droite, laissant trois à cinq millimètres d’espace entre chaque échantillon. Lorsque tous les cerveaux ont été intégrés, placez la vaisselle à quatre degrés Celsius pour permettre à l’agarose de solidifier et de sculpter les trois cerveaux en un seul bloc d’agarose, laissant environ trois millimètres de gel sur les bords des échantillons.
Collez le bloc à la surface d’une base de microtome et utilisez une lame chirurgicale pour couper tout le fond du bloc entre chaque échantillon de tissu pour obtenir trois blocs indépendants. Ensuite, utilisez une microtome de lame vibrante pour sectionner les blocs dans la solution krebs glacée en tranches épaisses de 250 micromètres, à l’aide d’une microspatule plate pliée pour recueillir uniquement les tranches contenant les éminences ganglionnaires médiales ou caudales. Ensuite, placez chaque section sur un diamètre individuel de 13 micromètres, des membranes filtrante de taille pore de huit micromètres flottant sur un milieu essentiel minimal dans des plats individuels de culture d’organe de centre de polystyrène bien.
Lorsque toutes les sections ont été obtenues, placez les plats dans un incubateur de culture de tissus de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant une heure. Avant l’injection d’ADN focale, placez des colonnes d’agarose d’un millimètre de diamètre et de 10 millimètres de long perforées avec une pipette en verre de 225 millimètres de long et de deux millilitres dans la solution krebs glacée. À l’aide d’une lame chirurgicale, couper un plus petit morceau d’agarose pour s’adapter à la surface de l’électroporation électrode et un plus gros morceau à utiliser comme base pour les injections d’ADN focal.
Ensuite, placez les blocs d’agarose dans la solution krebs glacée. Pour l’injection, mélanger l’ADN vecteur d’expression et de contrôle à une concentration d’un microgramme par microlitre pour chaque vecteur et ajouter une solution de stock vert rapide à une dilution d’un à dixe. Remplissez un diamètre intérieur tiré de 0,5 millimètre, une micropipette extérieure de diamètre d’un millilitre avec 10 microlitres du mélange d’ADN et chargez la micropipette dans un injecteur pneumatique de PicoPump.
Placez le plus grand bloc d’agarose sous un microscope stéréo et placez la tranche à injecter sur le morceau d’agarose. Ensuite, injectez des volumes de 25 à 50 nanolitres dans la région d’éminence ganglionnaire médiale ou caudale de la tranche. Immédiatement après l’injection, placez le petit bloc d’agarose sur l’électrode de boîte de Petri et utilisez une microspatule plate pour fixer la colonne d’agarose à l’électrode mobile de couverture.
Transférer la tranche injectée avec sa membrane de soutien sur le bloc agarose et placer l’électrode supérieure avec la colonne agarose sur le dessus de la région sélectionnée de la tranche. Puis, électroporer la région avec deux impulsions de cinq millisecondes de 125 volts, à 500 millisecondes l’une de l’autre. Après l’électroporation, remettre la tranche avec sa membrane de soutien dans son plat de fixation et remettre le plat dans l’incubateur de culture tissulaire.
Après une heure, remplacer le milieu essentiel minimal par un milieu de base approprié pour les cultures neuronales primaires et retourner les tranches à l’incubateur pendant la nuit. Dans ces expériences d’électroporation, environ 50% des neurones positifs GFP ont co-exprimé la protéine injectée positive de DP et donc, la population négative positive de RFP de GFP a servi de contrôle interne pour l’effet des ligands injectés d’ADN. L’administration de clozapine et d’oxyde augmente sélectivement l’activité des cellules positives transfected de DP, comme démontré par l’expression de la protéine activité-dépendante, c-Fos, dans ces sections de tissu coronal nouveau-né.
Le traitement de clozapine et d’oxyde a également comme conséquence une augmentation de la proportion des cellules RFP-positives de GFP-positives par rapport au nombre de cellules RFP-positives de GFP-négatives comparées aux littermates administrés par véhicule. Cette procédure peut être utilisée pour étudier les effets des interneurones greffés modulés par activité sur la plasticité circulatoire et la fonction cérébrale de l’hôte.
