Bu yöntemle, kortikal internöron öncüllerinin olgunlaşması üzerine içsel aktivitenin etkilerini inceleyebiliriz. Bu teknik, bilim camiasının çoğunluğu tarafından erişilebilir kortikal internöron progenitors hücresel özellikleri hedefleme ve manipüle için etkili bir yol sağlar. Bu protokol, numune lerin ve ekipmanların titizlikle işlenmesini içerir ve görsel gösteri ile en iyi şekilde takdir edilebilir.
Su geçirmez bir kalem kullanarak, altı 35 milimetrelik Petri yemekleri alt yüzeyinin alt kısmının ortası boyunca düz bir çizgi çizin. PBS'de 35 milimetrelik Petri yemeklerinin ikisine 10 mililitre sıvı %4 düşük jelleştirici agarose ekleyin ve her numune arasında üç ila beş milimetre boşluk bırakarak, düz hat boyunca her çanak başına aşağı bakan koku ampulleri ile agarose üç ila dört parçalanmış beyin gömmek. Tüm beyinler gömülü olduğunda, agarose katılaşmak ve agarose tek bir blok içine üç beyin oyma izin vermek için dört derece santigrat derece bulaşıkları yerleştirin, örneklerin kenarlarında jel yaklaşık üç milimetre bırakarak.
Bir mikrotom tabanının yüzeyinde blok tutkal ve üç bağımsız blok elde etmek için her doku örneği arasında bloğun alt tüm yol kesmek için bir cerrahi bıçak kullanın. Daha sonra, 250 mikrometre kalınlığında dilimler halinde buz soğuk Krebs çözüm blokları bölüm için bir titreşimli bıçak mikrotom kullanın, medial veya kaudal ganglionic eminences içeren sadece dilimleri toplamak için bükülmüş bir düz microspatula kullanarak. Daha sonra, bireysel polistiren merkezi iyi organ kültürü yemekleri minimal temel ortamda yüzen bireysel 13 mikrometre çapı, sekiz mikrometre gözenek boyutu filtre membranlar üzerine her bölümü yerleştirin.
Tüm bölümler elde edildiğinde, bir saat boyunca 37 santigrat derece bir karbondioksit doku kültürü kuluçka içinde bulaşıkları yerleştirin. Odak DNA enjeksiyonundan önce, buz gibi Krebs çözeltisine bir milimetre çapında, 225 milimetre uzunluğunda, iki mililitre kapasiteli cam pipetle delikli 10 milimetre uzunluğunda agarose kolonları yerleştirin. Bir cerrahi bıçak kullanarak, elektroporasyon elektrot yüzeyine sığacak şekilde agarose bir küçük parça ve odak DNA enjeksiyonları için bir üs olarak kullanılmak üzere bir büyük parça kesti.
Sonra, buz soğuk Krebs çözeltisi içine agarose blokları yerleştirin. Enjeksiyon için, her vektör için mikrolitre konsantrasyonu başına bir mikrogram da ifade ve kontrol vektör DNA karıştırın ve bir ila 10 seyreltme hızlı yeşil stok çözeltisi ekleyin. Çekilen 0,5 milimetrelik iç çapı, bir mililitrelik dış çaptaki cam mikropipeti 10 mikrolitre DNA karışımıyla doldurun ve mikropipeti pnömatik PicoPump enjektöre yükleyin.
Bir stereo mikroskop altında agarose büyük blok yerleştirin ve agarose parçası üzerine enjekte edilecek dilim yerleştirin. Daha sonra, dilimin seçilen medial ganglionik veya kaudal ganglionik saygınlık bölgesine 25 ila 50 nanolitre hacim enjekte edin. Enjeksiyondan hemen sonra, Petri çanak elektrot üzerine küçük agarose blok yerleştirin ve mobil kapak elektrot agarose sütun eklemek için düz uçlu microspatula kullanın.
Enjekte edilen dilimi destek membranı ile agarose bloğuna aktarın ve üst elektrodu agarose sütunu ile dilimin seçilen bölgesinin üzerine yerleştirin. Sonra, 125 volt, 500 milisaniye arayla iki beş milisaniyelik darbeler ile bölgeyi elektroporate. Elektroporasyondan sonra, destek membranı ile dilimi geri tutma kabına yerleştirin ve kabı doku kültürü kuluçka makinesine geri döndürün.
Bir saat sonra, birincil nöronal kültürler için uygun temel bir orta ile minimal temel orta değiştirin ve bir gecede kuvöz için dilimleri iade. Bu elektroporasyon deneylerinde, GFP pozitif nöronların yaklaşık %50'si RFP pozitif enjekte edilen proteini birlikte ifade etti ve bu nedenle GFP pozitif RFP negatif popülasyon, enjekte edilen DNA ligandlarının etkisi için bir iç kontrol görevi gösterdi. Klozapin ve oksit uygulaması bu yenidoğan koronal doku kesitlerinde aktiviteye bağımlı protein c-Fos'un ekspresyonunda gösterildiği gibi transfected RFP pozitif hücrelerin aktivitesini seçici olarak arttırır.
Klozapin ve oksit tedavisi de gfp-pozitif RFP-pozitif hücrelerin in oranında bir artış ile sonuçlanır GFP-pozitif RFP-negatif hücrelerin sayısına göre araç uygulanan çöp ler ile karşılaştırıldığında. Bu prosedür, aktivite modüle aşılı internöronların dolaşım plastisite ve konak beyin fonksiyonu üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılabilir.
