Com este método, podemos estudar os efeitos da atividade intrínseca na maturação de precursores de interneurônio cortical. Essa técnica fornece uma forma eficiente de segmentar e manipular as propriedades celulares de progenitores de interneurônios cortical que são acessíveis à maioria da comunidade científica. Este protocolo envolve o manuseio meticuloso de amostras e equipamentos, e pode ser melhor apreciado pela demonstração visual.
Usando uma caneta impermeável, desenhe uma linha reta através da parte inferior da superfície inferior de seis placas de Petri de 35 milímetros. Adicione 10 mililitros de agarose de gelagem líquida de 4%baixo na PBS em duas das placas de Petri de 35 milímetros e incorpore de três a quatro cérebros dissecados na ágarose com as lâmpadas olfativas voltadas para baixo por prato através da linha reta, deixando de três a cinco milímetros de espaço entre cada amostra. Quando todos os cérebros tiverem sido incorporados, coloque os pratos a quatro graus Celsius para permitir que a agarose solidifique e esculpe os três cérebros em um único bloco de agarose, deixando aproximadamente três milímetros de gel ao redor das bordas das amostras.
Cole o bloco na superfície de uma base de microtome e use uma lâmina cirúrgica para cortar todo o fundo do bloco entre cada amostra de tecido para obter três blocos independentes. Em seguida, use um microtome de lâmina vibrando para secionar os blocos em solução krebs gelada em fatias de 250 micrômetros de espessura, usando uma microspatula plana dobrada para coletar apenas as fatias contendo as eminências gangliônicas medial ou caudal. Em seguida, coloque cada seção em membranas individuais de 13 micrômetros de diâmetro, de tamanho de oito micrômetros flutuando em meio essencial mínimo em pratos individuais de cultura de órgãos do centro de poliestireno.
Quando todas as seções tiverem sido obtidas, coloque os pratos em uma incubadora de cultura de tecido de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por uma hora. Antes da injeção de DNA focal, coloque uma milímetro de diâmetro, colunas de 10 milímetros de longa distância perfuradas com um vidro de 225 milímetros de comprimento, de capacidade de dois mililitros, em solução krebs gelada. Usando uma lâmina cirúrgica, corte um pedaço menor de agarose para caber na superfície do eletrodo de eletroporação e uma peça maior para ser usada como base para as injeções de DNA focal.
Em seguida, coloque os blocos de agarose em solução krebs gelada. Para a injeção, misture a expressão e controle o DNA vetorial a um micrograma por concentração de microliter para cada vetor e adicione uma solução de estoque verde rápido em uma diluição de um a décimo. Encha uma micropipette de vidro de 0,5 milímetros puxada de diâmetro interno, micropipette de vidro de diâmetro externo de um mililitro com 10 microliters da mistura de DNA e carregue a micropipette em um injetor pneumático picopump.
Coloque o bloco maior de agarose sob um microscópio estéreo e coloque a fatia a ser injetada no pedaço de agarose. Em seguida, injete volumes de 25 a 50 nanoliter na região de eminência gangliônica medial ou caudal selecionada da fatia. Imediatamente após a injeção, coloque o pequeno bloco de agarose no eletrodo da placa de Petri e use uma microspatula de final plana para anexar a coluna agarose ao eletrodo de tampa móvel.
Transfira a fatia injetada com sua membrana de suporte para o bloco de agarose e coloque o eletrodo superior com a coluna agarose em cima da região selecionada da fatia. Em seguida, eletroporar a região com dois pulsos de cinco milissegundos de 125 volts, 500 milissegundos de distância. Após a eletroporação, coloque a fatia com sua membrana de apoio de volta em seu prato de retenção e devolva o prato para a incubadora de cultura tecidual.
Após uma hora, substitua o meio essencial mínimo por um meio básico adequado para culturas neuronais primárias e devolva as fatias à incubadora durante a noite. Nestes experimentos de eletroporação, aproximadamente 50% dos neurônios positivos do GFP co-expressaram a proteína injetada positiva RFP e, portanto, a população negativa RFP positiva do RFP serviu como um controle interno para o efeito dos ligantes de DNA injetados. Clozapine e administração de óxidos aumentam seletivamente a atividade de células positivas de RFP transfecidas, como demonstrado pela expressão da proteína dependente da atividade, c-Fos, nessas seções de tecido coronal recém-nascido.
O tratamento de clozapina e óxido também resulta em um aumento na proporção de células RFP positivas de RFP positivos em relação ao número de células RFP-negativas RFP positivas em comparação com os companheiros de lixo administrados pelo veículo. Este procedimento pode ser usado para estudar os efeitos de interneurônios enxertados modulados por atividade na plasticidade circulatória e na função cerebral do hospedeiro.
