С помощью этого метода мы можем изучить влияние внутренней активности на созревание корковых интернейроновых прекурсоров. Этот метод обеспечивает эффективный способ таргетинга и манипулирования клеточными свойствами кортикального интернейрона прародителей, который доступен для большинства научного сообщества. Этот протокол включает в себя тщательное обращение с образцами и оборудованием, и его лучше всего оценить с помощью визуальной демонстрации.
Используя водонепроницаемую ручку, нарисуйте прямую линию посередине нижней части нижней поверхности из шести 35-миллиметровых чашек Петри. Добавьте 10 миллилитров жидкой 4%низкой гелеобразной агарозы в PBS в две из 35-миллиметровых чашек Петри и встраивайте от трех до четырех расчлененных мозгов в агарозу с обонятельными луковицами, обращенными вниз на тарелку по прямой линии, оставляя от трех до пяти миллиметров пространства между каждым образцом. Когда все мозги были встроены, поместите посуду на четыре градуса по Цельсию, чтобы агароза затвердеть и вырезать три мозга в один блок агарозы, оставляя около трех миллиметров геля по краям образцов.
Клей блок на поверхности основания микротомы и использовать хирургическое лезвие, чтобы сократить весь путь через дно блока между каждым образцом ткани, чтобы получить три независимых блоков. Далее, используйте вибрирующий микротом лезвия, чтобы разделить блоки в ледяном растворе Кребса на 250-микрометровые ломтики, используя изогнутые плоские микроспатулы, чтобы собрать только ломтики, содержащие медиальные или хвостовые ганглионные выемки. Затем поместите каждый раздел на отдельные 13-микрометровый диаметр, восемь микрометров пор размер фильтр мембраны плавающей на минимальной необходимой среде в отдельных полистирол центр хорошо орган культуры блюд.
Когда все разделы были получены, поместите посуду в инкубатор культуры двуокиси углерода на 37 градусов по Цельсию в течение одного часа. Перед фокусной инъекцией ДНК поместите одномиллиметровый диаметр, 10-миллиметровые агарозные колонны, пробитое стеклом длиной 225 миллиметров, стеклом емкостью два миллилитров в ледяной раствор Кребса. Используя хирургическое лезвие, вырезать один меньший кусок агарозы, чтобы поместиться на поверхности электрода электропорации и один большой кусок, который будет использоваться в качестве основы для фокусных инъекций ДНК.
Затем поместите блоки агарозы в ледяной раствор Кребса. Для инъекции смешайте экспрессию и контроль векторной ДНК при концентрации одного микрограмма на микролитер для каждого вектора и добавьте быстрый зеленый раствор при разбавлении от одного до 10. Заполните вытащил 0,5-миллиметровый внутренний диаметр, один миллилитр наружного диаметра стеклянный микропипет с 10 микролитров смеси ДНК и загрузить микропайпет в пневматический picoPump инжектор.
Поместите большой блок агарозы под стерео микроскопом и поместите ломтик, который будет введен на кусок агарозы. Затем ввимите от 25 до 50-нанолитровых томов в выбранную медиальной ганглионной или каудальной ганглия в области эмуляции ломтика. Сразу же после инъекции поместите небольшой блок агарозы на электрод чашки Петри и используйте плоский конец микроспатула, чтобы прикрепить колонку агарозы к мобильному электроду крышки.
Перенесите вводимый ломтик с поддерживающей мембраной на блок агарозы и поместите верхний электрод с колонкой агарозы поверх выбранной области ломтика. Затем, электропорат области с двумя пять миллисекундных импульсов 125 вольт, 500 миллисекунд друг от друга. После электропорации поместите ломтик с поддерживающей мембраной обратно в его удерживающую тарелку и верните блюдо в инкубатор культуры тканей.
Через час замените минимальную необходимую среду базовой средой, подходящей для первичных нейронных культур, и верните ломтики в инкубатор на ночь. В этих экспериментах электропорации, приблизительно 50% из GFP положительных нейронов co-expressed положительный впрыскиваемый протеин RFP и поэтому, GFP положительное отрицательное население RFP служило как внутренний контроль для влияния впрыснутых лигандов дна. Администрация Клозапина и оксида избирательно повышает активность трансфицированных положительных клеток RFP, о чем свидетельствует экспрессия зависимого от активности белка c-Fos в этих новорожденных короналовых тканях.
Клозапин и оксид лечения также приводит к увеличению доли GFP-положительных RFP-положительных клеток по сравнению с числом GFP-положительных RFP-отрицательных клеток по сравнению с транспортным средством вводят littermates. Эта процедура может быть использована для изучения влияния активности модулированных привитых интернейронов на пластичность кровообращения и функцию мозга хозяина.
