Les produits naturels sont souvent biosynthésisés comme une classe de composés, et non comme un seul produit. Le filtrage diagnostique de fragmentation est une approche simple pour détecter tous les composés structurellement liés dans un mélange complexe. Le filtrage de la fragmentation diagnostique, implémenté dans le logiciel MZmine, permet à l’analyste d’explorer des ensembles de données de spectrométrie de masse pour de nouveaux produits naturels qui, autrement, seraient manqués.
Cela inclut de nouveaux bioproduits, ainsi que de nouvelles toxines. Le filtrage diagnostique de fragmentation, appliqué aux classes de toxines qui contaminent les aliments et l’eau, peut éclairer les évaluations de l’exposition. Lorsqu’il est appliqué sur des extraits microbiens et végétaux, il peut entraîner la découverte de nouveaux composés.
L’utilisation du filtrage à fragmentation diagnostique exige une compréhension des principales caractéristiques de spectrométrie de masse tandem qui définissent une classe chimique. Cela signifie que des composés structurellement similaires généreront des ions caractéristiques. Je m’appelle Shawn Hoogstra.
Je suis un technicien de recherche et développeur de logiciels à notre centre, et je vais démontrer la procédure. Pour préparer un échantillon pour l’analyse de la microcystine, inoculer 30 millilitres de cyanobactéries stériles de croissance moyenne à environ cinq fois-10-à-la-cinquième cellules par millilitre, dans des conditions aseptiques, dans des flacons Erlenmeyer de 250 millilitres, la surveillance de la densité cellulaire avec un hemocytomètre. Après 26 jours de culture photoautotrophique, éclairés par une lumière fluorescente blanche fraîche utilisant un régime clair-foncé de 12 heures à 27 degrés Celsius, avec tourbillonnant une fois par jour, utilisez des papiers filtres en microfibre en verre GF/C de 47 millilitres de diamètre pour séparer les cellules du milieu de culture par filtration sous vide.
Ajouter trois millilitres de 80% de méthanol aux cellules récoltées dans des tubes à essai de 14 millilitres, et vortex et sonifier par la suite chaque tube pendant 30 secondes. Après la sonication, lyse les échantillons avec trois cycles consécutifs de gel d’une heure, moins-20 degrés Celsius, et 15 minutes cycles de dégel de température ambiante, et filtrer chaque extrait de cellules cyanobactéries résultant par des filtres individuels de seringue de polytétrafluoroethylène de 0,22 micromètre. À l’aide d’un doux flux de gaz azoté, séchez les extraits à l’aide d’un évaporateur à 30 degrés Celsius et stockez les extraits à sec à moins-20 degrés Celsius.
Pour l’analyse de spectrométrie de masse en tandem chromatographie liquide, reconstituer les résidus séchés à analyser avec 500 microlitres de 90% de méthanol, et vortex les échantillons pendant 30 secondes. Transférer dans un flacon de chromatographie liquide haute pression ambrée. Analysez ensuite l’extrait de cyanobactéries à l’aide d’une méthode d’acquisition dépendante des données sur un spectromètre de masse haute résolution selon les protocoles standard.
La plupart des microcystines contiennent un résidu d’ATA qui produit deux ions de produit diagnostiques dans la spectrométrie de masse tandem, M par Z 135.0803, et 163.1114. Pour la chromatographie liquide non ciblée tandem spectrométrie de masse préparation ensemble de données, ouvrir MZmine 2, et sélectionnez Raw data import"under Raw data methods"drop-down menu. Sélectionnez ensuite les fichiers de données à partir de l’analyse de la microcystine, et sélectionnez le filtre de sélection de pointe pour appliquer un algorithme de centroïde fourni par le fournisseur.
Pour le filtrage de fragmentation diagnostique, ou DFF, des fichiers d’acquisition dépendants des données importés, utilisez le curseur pour mettre en surbrillance les fichiers de données et ouvrez le menu visualisation « drop-down » pour sélectionner l’option DFF. Dans la boîte de dialogue DFF qui apparaît, entrez la plage de temps et de minutes de rétention lorsque la classe ciblée d’analytes s’élit, et pour trouver la plage de ratio masse-charge de la classe ciblée d’analytes, y compris la possibilité de plusieurs composés chargés le cas échéant. Entrez la précision de masse de spectrométrie de masse tandem réalisable de l’instrument de spectrométrie de masse et entrez les ions de produit spécifiques à la classe du rapport masse-charge.
Entrez les pertes neutres propres à la classe et définissez l’intensité minimale des ions de produits diagnostiques et/ou des pertes neutres à considérer comme un pourcentage du pic de base des spectres de spectrométrie de masse tandem. Sélectionnez ensuite un chemin et un nom de fichier pour produire les résultats et cliquez sur OK"pour démarrer le DFF. Un terrain DFF apparaîtra à la suite d’une fin réussie de la configuration.
L’analyste doit interpréter les spectres de masse tandem de composés connus au sein d’une classe composée pour identifier les ions du produit et/ou les pertes neutres qui sont diagnostiques pour toute la classe de composés. Cette parcelle DFF a été générée à la suite de l’analyse de M.aeruginosa CPCC 300. L’axe x représente ce rapport masse-charge des ions précurseurs qui satisfaisaient aux critères définis du DFF, tandis que l’axe y montre le rapport masse-charge de tous les ions produits dans les spectres de spectrométrie de masse tandem de microcystines.
Pour cette analyse, les critères de détection de la microcystine comprenaient des ions précurseurs dans le rapport masse-charge de 400 à 1 200 et des temps de rétention entre deux et six minutes. Plus important encore, ces spectres de spectrométrie de masse tandem contenaient les deux ratios masse-charge supérieurs au seuil d’intensité maximale de base défini de 15 %. Sur les 4 116 spectres de spectrométrie de masse tandem acquis au cours de l’analyse, 26 satisfaisaient aux critères du DFF et ont été détectés dans l’extrait M.aeruginosa CPCC 300.
Les principales microcystines détectées pourraient être assignées en toute confiance sous forme d’arginine de leucine de microcystine et de microcystine d’acide aspartique déméthylique lucine arginine. Au fur et à mesure que de nouveaux composés sont découverts à l’aide du filtrage diagnostique de la fragmentation, les organismes peuvent être cultivés à grande échelle pour l’isolement et la caractérisation des composés par NMR. Lorsqu’il est appliqué aux microcystines, le filtrage diagnostique de fragmentation nous permet de déterminer si les méthodes traditionnelles de dépistage ciblées détectent les principales toxines présentes dans un échantillon.
