La microscopie cellulaire vivante permet aux chercheurs d’étudier la dynamique nucléaire de la levure de fission dans la mitose et la méiose en temps réel. La force de cette méthode provient de l’étude des processus nucléaires dans les cellules vivantes dans des conditions physiologiques normales qui élimine le besoin de fixatifs toxiques et de taches. Cette technique répond aux questions liées au timing, à la stabilité et à la mobilité des protéines qui peuvent ne pas être utiles à la manipulation génétique ou biomécanique.
Il est essentiel de prêter une attention particulière à la santé et la forme physique des cellules de levure de fission avant l’imagerie. Examinez toujours la morphologie et les caractéristiques de croissance pour assurer la cohérence des résultats entre les expériences. Ce protocole montre la façon relativement simple de préparer des diapositives au microscope qui, lorsqu’elles sont maîtrisées correctement, peuvent améliorer la cohérence et la reproductibilité de l’imagerie cellulaire vivante prolongée.
Pour commencer à ramasser la matière cellulaire de la plaque de réveil cryogénique, stries-la sur les plaques OUI, et les incuber à 25 degrés Celsius ou 32 degrés Celsius selon le génotype de levure pour réveiller les souches de levure de fission de la conservation cryogénique. Ensuite, utilisez une boucle stérile pour ramasser les cellules des colonies individuelles dans les souches de levure de fission éveillées et les inoculer dans des tubes à essai contenant trois millilitres de milieu liquide YES. Placez les tubes dans un shaker à 150 à 220 rpm pour croître à 25 ou 32 degrés Celsius pendant la nuit jusqu’à la phase de journal tardif avec une lecture de densité optique désirée de 0,7 à 1,0.
Transférer 10 microlitres de la culture sur une lame de microscope. Mettez un coverslip dessus et placez-le sous un microscope pour vérifier la morphologie cellulaire appropriée et l’état nutritionnel. Pour mettre en place une toboggan au microscope pour l’analyse de la mitose ou de la méiose, ajoutez d’abord deux grammes d’agarose dans le flacon de 500 millilitres contenant 100 millilitres de milieu minimal plus suppléments pour la mitose ou le milieu de sporulation liquide pour la méiose.
Réchauffer la solution d’agarose dans un four à micro-ondes à 60% de puissance par incréments de 10 secondes ou placer le bécher dans un bain d’eau de 55 degrés Celsius pendant 10 minutes. Faites tourbillonner la solution pour assurer une fonte efficace. Installez deux glissières de microscope sur un support de pointe pipette avec la glissière supérieure reposant sur deux piles de ruban de laboratoire aux deux extrémités comme support faisant une forme croisée.
Réglez la distance entre les deux glissières à plus de deux millimètres afin de former un tampon épais dans les étapes suivantes pour une imagerie prolongée. Après avoir refroidi l’agarose fondue pendant une minute à température ambiante, retirez la lame supérieure et utilisez une pointe de pipette à alésage large pour distribuer de 50 à 100 microlitres sur la glissière inférieure pour faire une place. Avant que l’agarose se refroidisse placer la diapositive supérieure sur le dessus pour générer une garniture de propagation d’environ un et 1/2 à deux centimètres de diamètre.
L’imagerie cellulaire vivante optimale est essentielle pour les étapes ultérieures de traitement des données. Assurez-vous d’éliminer les babioles d’air dans l’agarose fondue et de créer un tampon mince pour les périodes d’imagerie de plus de quatre heures. Pour examiner les événements mitotiques cultiver des cellules à partir de cultures de démarrage soit dans emm liquide ou PMG plus suppléments pendant la nuit.
Transférer un millilitre de la culture dans une cuvette et mesurer sur le spectrophotomètre à une longueur d’onde de 595 nanomètres. La croissance cellulaire est considérée comme une phase médiane lorsque la densité optique atteint 0,4. Puis centrifugeuse d’un millilitre de la suspension cellulaire à 1375 fois g pendant une minute.
Retirez le supernatant et resuspendez la pastille cellulaire dans un milieu minimal plus des suppléments à un volume final de 100 microlitres. Pour l’image des événements méiotiques cultiver des cellules à partir de cultures de démarrage dans un milieu minimal plus suppléments pendant la nuit. La croissance cellulaire est considérée comme une phase de journal tardif lorsque la densité optique à 595 nanomètres se situe entre 0,7 et un.
Ensuite, à partir des cultures de grumes tardives obtenir 500 microlitres de chaque souche de type compagnon, H négatif et H positif, et se combiner pour faire une suspension cellulaire d’un millilitre. Centrifuger les cellules à 1375 fois g pendant une minute. Retirer le supernatant et resuspendre la pastille en un millilitre d’extrait de maltose liquide.
Répétez le lavage à l’extrait de maltose trois fois de plus pour assurer un élimination efficace des nutriments. Après le dernier lavage à l’extrait de maltose, resuspendez les cellules en un millilitre d’extrait de maltose et transférez le mélange dans un flacon de 50 millilitres contenant neuf millilitres d’extrait de maltose. Incuber de 12 à 16 heures à 22 à 25 degrés Celsius à une vitesse de rotation minimale comprise entre 50 et 100 rpm.
L’apparition de nombreux touffes rondes de levure de fission résultant de l’auto-flocculation abondante indique un accouplement efficace. Ensuite, prélivez un échantillon d’un millilitre de la culture de l’accouplement et de la centrifugeuse à 1 375 fois g pendant une minute. Enlevez 750 microlitres du supernatant et réutilisez les cellules dans le surnatant restant.
Vortex vigoureusement pendant cinq secondes pour perturber les touffes. Distribuez 20 microlitres d’une suspension de cellule mitotic ou méiotique sur un pad d’agarose de 2%. Retirez tout excès de milieu en inversant la lame et en la mettant sur le dessus de l’essuie-tout sans peluche pendant deux à trois secondes.
Retournez la lame et placez doucement un couvercle en verre sur le dessus de la garniture, en veillant à ne pas générer de bulles d’air. Pour créer une monocouche cellulaire faire pivoter le coverslip dans le sens des aiguilles d’une montre avec l’index pour un tour complet pour les cellules de mitose ou deux tours complets pour les cellules de méiose. Assurez-vous que la matière cellulaire se disperse à travers la garniture d’agarose permettant une meilleure séparation des cellules simples ou des asci.
À l’aide d’un petit bâton en bois, distribuez le scellant en hydrocarbures fondu le long des bords du coverslip pour sceller chaque coussin agarose. Une fois que la garniture d’agarose est scellée placez-la sur l’étape de microscope. Allumez la chambre de température et réglez-la à la température désirée.
Placez une assiette avec une serviette en papier humide dans la chambre pour contrôler l’humidité du système de microscope. Laissez-le équilibrer pendant 10 à 15 minutes aux conditions d’imagerie appropriées. Cela permet à toutes les bulles d’air restantes de se dissiper et tout changement d’agarose de dernière minute se produit.
Utilisez l’objectif 40X pour trouver les champs de vision appropriés à l’image. Passez à l’objectif 60X pour commencer l’acquisition de données. Dans le logiciel qui contrôle la fonction microscope choisir les ensembles de filtre microscope qui correspondent le mieux aux fluorophores en observation.
Ajustez les longueurs d’onde d’excitation pour correspondre aux fluorophores utilisés, utilisez la puissance d’excitation la plus faible qui produit un signal cohérent et utilisez des temps d’exposition de quatre à huit heures pour générer des données d’imagerie acceptables mais quantifiables et reproductibles. Cumulez au moins six points de temps d’acquisition toutes les heures. Dans le logiciel de collecte d’images sélectionnez au moins un canal de fluorescence à partir duquel acquérir des données et utiliser un stock Z composé de 13 sections avec espacement de 0,5 micromètre.
Dans le logiciel Fidji télécharger une image décontvolée en sélectionnant la fonction Bio-Formats Importateur sous le menu plug-ins. Dans la fenêtre pop-up import options, sélectionnez Hyperstack, mode Couleur par défaut, vérifiez l’échelle automatique et appuyez sur le bouton OK. Assurez-vous que la fenêtre affichée a le nombre correct de canaux de fluorescence et les délais en faisant défiler latéralement sur les barres respectives en bas.
Enregistrer sous forme de fichier Tiff qui ne comprime pas les données. Ensuite, sous le menu Analyser, utilisez l’option Mesures définies pour choisir différents paramètres. Par exemple : Zone, valeur grise min max, densité intégrée, valeur grise moyenne, médiane, position de pile, périmètre et étiquette d’affichage.
Sélectionnez Couleur et cliquez sur l’outil Canaux. Dans la fenêtre pop-up channels, vérifiez le canal couleur pour lequel l’intensité ou la zone sera mesurée. Sélectionnez l’image, puis tapez et cliquez sur 32 bits.
Choisissez les fonctionnalités Adjust et Threshold sous le menu Image. Vérifiez la case fond sombre, sélectionnez la méthode Par défaut et choisissez Rouge pour superposer les signaux d’intérêt. Utilisez l’outil baguette magique pour mettre en évidence chaque structure d’intérêt et appuyez sur la lettre T sur le clavier pour ajouter le retour sur investissement sélectionné à la fenêtre pop-up roi manager.
Ensuite, ouvrez le dossier roi zippé pour charger le gestionnaire roi et cliquez sur chaque identificateur roi dans le panneau latéral gauche. Sélectionnez Mesurer dans le menu Analyser et répétez cette commande sur chaque identificateur roi pour quantifier les objets d’intérêt dans toutes les tranches de la pile d’images. Enregistrez les résultats en tant que fichier CSV pour l’analyse statistique.
Dans cette étude si les cellules meurent de faim en raison de la limitation des nutriments ou de la prolifération, elles montreront des vacuoles excédentaires et une diminution de la taille des cellules. Les cellules logarithmiques montrent la réplication active de l’ADN et la division cellulaire, ainsi que l’expression pannucléaire de Tos4-GFP et la séparation des foyers Sad1-DsRed. Le défaut de s’accoupler, comme c’est le cas lorsque les cellules ne sont pas suffisamment affamées d’azote, les empêchera d’entrer dans la méiose.
Une paire de cellules de fission subissant la karyogamie sont montrées. La flocculation robuste de la suspension cellulaire d’accouplement augmente l’interaction cellule-cellule et indique ainsi l’accouplement réussi et l’induction méiotique efficace. Les asci zygotiques prennent de multiples formes, y compris les formes zig-zag et bananes.
Dans la mitose pendant que les cellules passent de la métaphyse à la télophase, le premier changement implique une contraction de la taille nucléaire dans la métaphyse, tandis que le second montre la division de noyau pendant l’anaphase. En plus de partager une certaine dynamique de ségrégation avec les cellules mitotiques, les cellules méiotiques présentent une oscillation nucléaire lors de la recombinaison homologue et une réduction supplémentaire des nucléosides à la fin de l’anaphase II.It est la responsabilité des chercheurs de s’assurer que les paramètres de l’expérience peuvent être reproduits entre les expériences, et que les données recueillies sont aptes à l’analyse en aval. L’imagerie cellulaire vivante a permis aux chercheurs d’examiner en détail les mécanismes de la division nucléaire dans la mitose et la méiose.
À mesure que les étiquettes fluorescentes et les capacités du microscope amélioreront le nombre et le type de processus que nous pouvons observer augmenteront.
