Il s’agit d’un traitement simple qui peut être appliqué à n’importe quelle lignée de cellules souches ou protocole de différenciation aux cellules de choix pour la différenciation. Tout ce qu’on a à faire est d’ajouter DMSO à 1-2% dans le milieu de maintenance de la culture cellulaire. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’augmenter significativement le potentiel de différenciation des cellules souches pluripotentes dans n’importe quelle lignée de choix en amorçant les cellules pour la différenciation.
Le traitement par DMSO augmente les chances que les cellules se différencient des iPSC dérivés du patient, ce qui leur permet d’être utilisées pour la thérapie de remplacement cellulaire, la modélisation des maladies et le dépistage des médicaments. Elle peut donner lieu à l’apparition précoce d’une réglementation qui contrôle la sous-prolifération, la différenciation et les spécifications au cours du développement embryonnaire. Nous avons démontré que le traitement DMSO améliore la différenciation dans près de 50 lignées de cellules souches pluripotentes embryonnaires et induites.
Alors que d’autres laboratoires ont montré qu’il est bénéfique pour les cellules souches d’autres espèces, comme la souris et le primate. Un jour avant le début de la différenciation, ajoutez DMSO à une concentration de 1 ou 2% pendant 24 heures dans votre support d’entretien typique. 24 heures après le traitement DMSO, remplacez le milieu et procédez à votre protocole de différenciation habituel.
Cultiver des cellules selon les instructions manuscrites. Lorsque les cellules atteignent une confluence appropriée, dissociez-les et préparez une suspension à cellule unique. Comptez les cellules vivantes à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatiques, à l’aide d’un marqueur de viabilité tel que le bleu trypan.
Afin d’atteindre 80-90% confluency dans le pré-traitement de 24 heures DMSO, plaquez les cellules sur une plaque enduite de six puits à une densité de 500.000 à 1 million de cellules par puits. Incuber les cellules pendant 24 heures à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone. Ensuite, aspirez les médias et remplacez-les par une solution DMSO de 1 à 2 %.
Laissez les cellules couver pendant 24-28 heures avant la différenciation. Si vous couvez pendant 48 heures, remplacez le média après 24 heures par une solution DMSO fraîche. Pour atteindre la différenciation de la culture 3D, grandir et recueillir les cellules dans une suspension cellulaire.
Comptez les cellules vivantes et plaquez-les dans une plaque de six puits non encoated et à faible attachement dans les médias de cellules souches avec inhibiteur de ROCK. En règle générale, des sphères de cellules souches pluripotentes humaines 3D se forment dans les 24 heures. Laissez les cellules couver pendant 24 heures à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone.
Préparer 1-2%DMSO dans les médias de cellules souches préchauffées selon les instructions manuscrites. Pour remplacer le média après l’incubation, inclinez la plaque à un angle de 30 à 45 degrés et laissez les sphères cellulaires s’installer au fond du puits. Aspirez les supports des cellules et suspendez-les doucement dans la solution DMSO.
Laissez les cellules couver pendant 24-48 heures à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone. Pré-traiter les cellules avec DMSO tel que décrit pour les cultures 2D, et préparer noggin et SB431542 solutions de stock. Préparez suffisamment de remplacement de sérum de 10%KNOCKOUT, ou KOSR, dans knockout DMEM pour trois à quatre jours de changement de médias.
Préparez des supports de différenciation ectodermique en ajoutant de la noggine et du SB431542 au DMEM KO KOSR préchauffé tel que décrit dans le manuscrit. Après le prétraitement du DMSO, aspirer les médias des cellules et ajouter deux millilitres de médias de différenciation à chaque puits. Laissez les cellules couver pendant trois à quatre jours à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone, remplaçant quotidiennement les médias par de nouveaux facteurs de différenciation.
Le pré-traitement du DMSO entraîne une diminution transitoire et dépendante de la dose du taux de croissance cellulaire par rapport aux cellules non traitées. Cette diminution de la prolifération est associée à une augmentation du contact cellule à cellule, qui est particulièrement prononcée dans les cellules traitées à 2 % par le DMSO. Lorsque les cellules sont fixées et tachées pour les marqueurs prototypiques de chaque couche germinale, on peut voir que 2% DMSO pré-traitement entraîne une proportion accrue de cellules différenciées couche germinale.
Par exemple, SOX17 a été taché pour visualiser les cellules endoderm. Afin d’étudier l’effet du DMSO sur la différenciation des types de cellules progénitrices du système nerveux central, les cellules souches pluripotentes induites par l’homme pourraient être différenciées en cellules progénitrices neurales ou en cellules progénitrices oligodendrocytes. Comparé aux cellules de contrôle, le pré-traitement de 2%DMSO augmente l’expression du marqueur de cellules progénitrices neurales Pax6.
De même, le pré-traitement augmente la proportion de cellules exprimant oligodendrocyte marqueur cellulaire ancêtre Olig2. En outre, le traitement initial de DMSO améliore la fonction embryonnaire humaine de cellules souches dérivées après transplantation in vivo. Lorsque des cellules progénitrices pancréatiques différenciées sont transplantées sur des souris immunodéficientes, leur fonctionnalité peut être testée en réponse à un défi de glucose ou à une stimulation KCl.
Les améliorations de la fonctionnalité cellulaire sont évidentes de deux semaines à 16 semaines après la transplantation. La considération la plus importante à prendre en compte est le temps de cycle ou de doublement de vos cellules souches. La durée du traitement DMSO devrait être la même que le temps de cycle des cellules.
Après le traitement initial du DMSO, on peut comprendre comment la prolifération cellulaire et le cycle cellulaire sont régulés dans les cellules souches, car le traitement aide à promouvoir l’arrêt de la croissance dans la phase G1 du cycle cellulaire. Les cellules différenciées peuvent être utilisées pour comprendre les mécanismes liés à la maladie, pour la co-culture avec d’autres types de cellules, dans les tests de tumorigénicité, et dans des analyses fonctionnelles ou des études de transplantation pour déterminer si les cellules différenciées peuvent sauver un phénotype de la maladie.
