Nous présentons un protocole pour préparer des cultures de tranches flottantes à partir de tissus cérébraux prélevés sur des donneurs humains vivants soumis à la chirurgie cérébrale réséctive. Cette culture est agréable à effectuer des analyses biochimiques et cellulaires de biologie ou de l’immunohistochimie. On s’attend à ce qu’il contribue à l’élucidation du mécanisme sous-jacent à la neurodégénérescence dans les maladies cérébrales associées.
Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une alternative plus simple et rentable au protocole classique de culture des tranches à l’aide d’inserts membranaires. Bien que le protocole global ne soit pas complexe, certaines étapes telles que l’enlèvement des méninges, le collage du tissu au disque de spécimen vibratome, et la résection pour l’immunohistochimie sont mieux comprises une fois démontrées visuellement. Niele Mendes et Glaucia Almedia, qui sont des étudiants diplômés, et Giovanna Nogueira, une autre étudiante diplômée, contribueront à démontrer la procédure.
Pour commencer cette procédure, ajouter du sel à un seau de glace. Transférer la solution de tranchage dans ce seau et laisser reposer sous le mélange de carbogen bouillonnant pendant au moins 20 minutes avant l’utilisation. Ensuite, préparez un bloc de 3% agarose qui est d’environ deux centimètres par deux centimètres par deux centimètres.
Super collez le bloc d’agarose au disque de spécimen vibratome afin de créer le soutien mécanique additionnel à l’échantillon de tissu pendant le tranchage. Sur le vibratome, réglez l’épaisseur de la section à 200 micromètres, la fréquence des vibrations à 100 hertz, et choisissez une vitesse de coupe comprise entre 0,5 et 1,0 millimètre par seconde. Verrouillez ensuite le plateau tampon vibratome à la base vibratoire et ajoutez de la glace pour la garder au réfrigérateur avant de recevoir la solution de tranchage et l’échantillon et tout au long de la procédure de tranchage.
Tout d’abord, mettre en place un appareil de transport qui se compose d’une bouteille de gaz portative contenant un mélange de carbogen relié à une soupape de flux de pression qui contrôle la sortie de gaz reliée à des tubes en silicone qui relie cette sortie de gaz au navire de transport et au navire de transport qui contient la solution de transport et la glace pour le refroidissement de l’échantillon pendant le transport. Recueillir et transporter le spécimen et le transport tel que décrit dans le protocole de texte. Transférer le spécimen dans une boîte de Pétri contenant une solution de tranchage.
À l’aide d’outils chirurgicaux fins, retirez soigneusement autant de méninges restantes que possible. Choisissez la meilleure orientation de spécimen pour produire des tranches avec les caractéristiques particulières de la conception expérimentale et utilisez une lame de scalpel numéro 24 pour couper une surface plane pour être la base qui sera collée au disque de spécimen. À l’aide d’une cuillère en plastique d’élimination et de pinceaux délicats, recueillir le fragment de la boîte de Pétri et sécher l’excès de solution avec du papier filtre.
Ensuite, utilisez de la colle super pour attacher le tissu au plat du spécimen vibratome jusqu’à ce qu’il soit fermement collé au plat et en contact avec le bloc agarose. Placez le disque de spécimen vibratome dans le plateau tampon vibratome. Verrouillez le porte-couteau en place avec la lame de rasoir fermement fixée.
Ajouter la solution de tranchage et s’assurer qu’elle couvre à la fois le spécimen et la lame. Ensuite, commencez à trancher le spécimen en tranches de 200 micromètres. Transférer les tranches du plateau tampon dans une boîte de Pétri contenant une solution de tranchage et couper les bords lâches et l’excès de matière blanche à une proportion d’environ 70% cortex et 30% de matière blanche.
Dans une armoire à écoulement laminaire, ajouter 600 microlitres de culture moyenne à chaque puits d’une plaque de 24 puits et incuber à 36 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant au moins 20 minutes avant le placage des tranches. Après cela, utilisez un pinceau pour plaquer une tranche dans chaque puits. S’il y a des puits inutilisés dans la plaque, remplissez-les de 400 microlitres d’eau stérile.
Incuber à 36 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Compléter 10 millilitres du milieu de culture précédemment préparé avec le facteur neurotrophique dérivé du cerveau à une concentration de 50 nanogrammes par millilitre. Après huit à 16 heures, retirer 333 microlitres du milieu conditionné de chaque puits et ajouter 133 microlitres de milieu frais complété par BDNF.
Remplacer un tiers du milieu conditionné par un milieu frais complété par bdnf toutes les 24 heures. Tout d’abord, transférer les tranches des puits contenant du milieu de culture à une nouvelle plaque de 24 puits contenant du PBS. Retirez le PBS de chaque puits et remplacez-le par un millilitre de paraformaldéhyde de 4 %.
Incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, retirez soigneusement le paraformaldéhyde des puits et remplacez-le par une millilitre de solution de saccharose à 30 %. Incuber à quatre degrés Celsius pendant 48 heures.
Après 48 heures, réglez la microtome de congélation à 40 degrés Celsius négatifs. Préparer une base de saccharose sur le stade de microtome où les tranches doivent être placées. Après avoir complètement gelé, couper une partie du saccharose congelé pour produire une surface plane sur laquelle la tranche sera placée.
Ensuite, placez chaque tranche sur un film plastique étiré et utilisez un pinceau pour aplatir le tissu. En un seul mouvement, transférer la tranche étirée à la base congelée de saccharose. Une fois la tranche reposée de cinq à dix minutes pour bien congeler, couper la tranche en 30 sections de micromètres.
Transférez les sections de 30 micromètres dans une boîte de Pétri contenant du PBS et passez à un protocole d’histologie adéquat pour la conception expérimentale. Lors de la détermination de la qualité et de la santé des tranches de culture, un aspect critique à évaluer est la présence et la morphologie typique des types de cellules neurales attendues, des neurones et des cellules gliales. L’architecture typique de la lamination corticale humaine est observée dans une tranche à la journée in vitro quatre révélée par immunolabeling neuronal.
En outre, la présence prévue de microglies et d’astroglies est également observée. Ces résultats démontrent que l’architecture tissulaire n’est pas significativement affectée ni par la procédure chirurgicale, ni par le traitement de l’échantillon, ni par la période in vitro à court terme. La réponse neuronale à la dépolarisation induite par le chlorure de potassium a également été quantifiée dans les tranches de culture en suivant la phosphorylation d’ERK.
Fait intéressant, une augmentation claire de la phosphorylation ERK est observée dans les tranches traitées au chlorure de potassium à la journée in vitro quatre. Enfin, la réponse des tranches à la journée in vitro quatre à un défi toxique est évaluée avec un peroxyde d’hydrogène oxydatif connu d’incitation d’effort. L’exposition des tranches au peroxyde d’hydrogène de 300 millimlaires pendant 24 heures a entraîné une forte diminution de la réduction du MTT.
Pris ensemble, la mort cellulaire massive observée dans la journée in vitro cinq tranches après le défi du peroxyde d’hydrogène et les résultats de dépolarisation induits par le chlorure de potassium indiquent la santé générale préservée des tranches à la journée in vitro quatre qui répondent à un stimulus toxique tel que le stress oxydatif. Ce protocole est principalement consacré à des études basées sur des analyses d’une durée de plus d’une semaine telles que l’étude des mécanismes moléculaires de neurotoxicité et de neuroprotection par les médicaments candidats. Bien que ce protocole soit consacré à l’utilisation de tissus corticals prélevés sur des patients soumis à un traitement chirurgical pour l’épilepsie microrésistante du lobe temporal, il est probable que les tissus prélevés dans d’autres régions ou affections du cerveau pourraient également être des sources pour produire des cultures de tranches flottantes.
Les cultures de tranches provenant du cerveau humain adulte peuvent être essentielles pour faire progresser notre compréhension des neuropathologies humaines en raison de leurs circuits cellulaires uniques et de leurs machines moléculaires dépourvues de tranches produites à partir du cerveau des rongeurs.
