Ce protocole décrit l’implantation orthotopique de cellules cancéreuses dérivées de patients dans la paroi du caecum de souris immunodéficientes. Ce modèle récapitule la maladie métastatique du cancer colorectal avancé. Le modèle orthotopique de cancer colorectal présenté ici récapitule le scénario clinique des tumeurs intestinales avancées et de la maladie métastatique chez les patients atteints d’un cancer colorectal qui ne peut pas être étudié à l’aide d’organoïdes dérivés du patient ou de modèles de xénogreffe dérivés du patient.
À partir d’une souris euthanasiée, extrayez la tumeur en la retirant soigneusement de la peau et des tissus non tumoraux environnants à l’aide de ciseaux et de pinces. Placez les tumeurs récoltées dans du PBS à quatre degrés Celsius. À l’aide d’une lame, dissocier les tumeurs dans une plaque de culture de 10 centimètres contenant un millimètre de milieu.
Placez l’échantillon dissocié homogène dans un tube conique de 15 millilitres. Ensuite, ajoutez le médium jusqu’à obtenir un volume final de cinq millilitres. Ensuite, ajoutez le milieu de digestion dans le tube.
Placez le tube à 45 degrés à l’intérieur d’un incubateur de culture cellulaire pendant une heure à 37 degrés Celsius. Pendant l’incubation d’une heure, mélangez la solution toutes les 15 minutes avec une pipette de cinq millilitres. Après l’incubation, ajoutez cinq millilitres de milieu et mélangez bien.
Ensuite, triez la solution à l’aide d’une crépine cellulaire de 100 micromètres à l’aide d’un tube stérile de 50 millilitres. Centrifuger les cellules triées à 500g pendant 10 minutes à température ambiante. Aspirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans trois millilitres de solution tampon de lyse des globules rouges 1x.
Incuber pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, ajoutez trois millilitres de milieu et mélangez l’échantillon. Centrifuger à 500g pendant 10 minutes à température ambiante et aspirer le surnageant.
Remettre la pastille en suspension avec cinq à 10 millilitres de milieu et utiliser un compteur de cellules pour calculer le nombre total de cellules. Après avoir centrifugé les cellules à 500g pendant 10 minutes à température ambiante, remettez en suspension 10 millilitres de PBS. Répétez la centrifugation et lavez avec 10 millilitres de PBS.
Remettre la pastille en suspension pour obtenir une concentration de 20 fois 10 à six cellules par millilitre et bien mélanger pour obtenir une suspension cellulaire homogène. Ensuite, préparez une seringue de 29 g pour l’injection de caecum. Chargez 50 microlitres de suspension de cellules tumorales dans la seringue et assurez-vous qu’il ne reste pas de bulles d’air dans la seringue.
Placez la seringue sur de la glace. Tout d’abord, stérilisez le site chirurgical en pulvérisant un détergent désinfectant et en essuyant. Ensuite, épilez l’abdomen à l’aide d’une machine d’épilation de souris.
Placez la souris en décubitus dorsal et désinfectez l’abdomen en frottant avec de la chlorhexidine ou de la povidone iodée. Faites une incision longitudinale d’un centimètre sur le bas-ventre à l’aide de ciseaux chirurgicaux. Séparez soigneusement la peau sur les côtés pour exposer le péritoine.
Ensuite, faites une incision de 0,5 à un centimètre dans la membrane du péritoine, suffisante pour extérioriser le caecum. À l’aide d’une gaze stérile prédécoupée, isolez soigneusement le caecum de la souris. Humidifier le caecum sous forme de solution saline tout au long de la procédure.
Immobiliser le caecum en le tenant soigneusement avec une pince, puis introduisez l’aiguille superficiellement dans la paroi du caecum. Lentement, injectez la totalité du volume de 50 microlitres de suspension de cellules tumorales. Ce processus prend environ 10 secondes.
Après l’injection, retirez lentement l’aiguille du caecum et appliquez une légère pression sur le site d’injection à l’aide d’un applicateur coton-tige. Nettoyez le caecum avec une solution saline pour éliminer tous les débris et remettez le caecum dans l’abdomen de l’animal. Fermez le péritoine à l’aide de sutures 5/0, puis fermez la peau de l’abdomen à l’aide de sutures 5/0.
Des tumeurs orthotopiques CRC-PDX ont été observées dans l’intestin de souris implantées avec des cellules cancéreuses dérivées de patients. L’analyse histologique par coloration à l’hématoxyline et à l’éosine sur le caecum a montré la présence de cellules tumorales. L’analyse histologique a également révélé des métastases pulmonaires et hépatiques chez les souris implantées.
Les souris porteuses de tumeurs orthotopiques ont été traitées soit avec le véhicule, soit avec le médicament de test, soit avec l’irinotécan, un médicament de chimiothérapie. L’analyse des images de micro-tomodensitométrie a montré que, par rapport au véhicule, le médicament testé induisait une réduction du volume tumoral, qui a été encore réduite en association avec le traitement par irinotécan. Ce modèle permettra d’étudier la biologie des métastases dans les tumeurs cancéreuses colorectales.
