Ici, nous présentons un protocole pour détecter la 5-hydroxyméthylcytosine dans les cellules et les tissus cérébraux utilisant l’immunofluorescence, la nouvelle méthode, et le point-tache d’ADN. La 5-hydroxyméthylcycytosine, c.-à-d. 5hmC, modification épigénétique atténuée, joue la fonction importante en réglementant l’expression de gène et impliquée dans les désordres neurologiques multiples.
En fait, nos méthodes peuvent être utilisées pour détecter 5hmC dans plusieurs cellules et les tissus. Il est pratique et peut être effectué avec des équipements communs dans le laboratoire. Commencez par positionner la souris face vers le haut sur une planche en plastique et en fixant chaque membre avec du ruban adhésif.
Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour couper à travers la peau et le muscle, et ouvrez la cavité thoracique. Exposez le cœur et coupez une petite partie de l’atrium droit avec de fins ciseaux chirurgicaux. À l’aide d’une seringue jetable de 10 millilitres et stérilisée, imprènuez la souris du ventricule gauche avec du PBS froid.
Ensuite, perfuser la souris avec 4%PFA jusqu’à ce qu’elle soit raide. Ensuite, ouvrez le crâne avec des forceps osseux et retirez le cerveau. Placez le cerveau dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres rempli de cinq millilitres de 4% de PFA et rangez-le à quatre degrés Celsius.
Après 24 heures, transférer le cerveau dans une solution de saccharose à 30% et le laisser à quatre degrés Celsius pour une déshydratation complète. Avant la section, imbed le cerveau dans le composé optimal de température de coupe et refroidir à moins 20 degrés Celsius pendant au moins une heure. Échantillons de cerveau de section à une épaisseur de 20 à 40 micromètres utilisant un microtome cryostat.
Recueillir les sections dans PBS et stocker à quatre degrés Celsius. Prenez les sections cérébrales d’intérêt et mettez-les dans une plaque de 24 puits avec PBS. Laver les sections avec PBS sur un shaker pendant 10 minutes.
Retirer le PBS et traiter avec de l’acide chlorhydrique hydrochlorique préchauffé d’une molaire à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. L’acide chlorhydrique est corrosif et s’il vous plaît le préparer dans la prise chimique. Ensuite, lavez les échantillons trois fois avec PBS pendant cinq minutes et bloquez-les avec PBS contenant 3% sérum de chèvre normal et 0,1%Triton X-100.
Laissez les échantillons sur un shaker à température ambiante pendant une heure. Ajouter des anticorps primaires spécifiques aux sections et incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius sur un shaker. Le lendemain, sortez les échantillons et laissez-les à température ambiante pendant une heure.
Lavez les échantillons trois fois avec du PBS et ajoutez des anticorps secondaires. Couvrir la plaque d’aluminium et la laisser à température ambiante pendant une heure en secouant. Après l’incubation, laver les échantillons trois fois avec du PBS et les monter sur des toboggans.
Ajouter 100 à 150 microlitres de support anti-fondu, couvrir d’un verre de couverture haut de gamme et sceller avec du vernis à ongles. Imagez les sections du cerveau avec un microscope régulier ou confocal. Pour isoler l’ADN génomique, commencez par disséquer les tissus de l’hippocampe, du cortex et du cervelet sur un plat refroidi à la glace.
Ajouter un millilitre de tampon de lyse d’ADN et moudre les tissus. Transférer l’échantillon dans un tube de microcentrifugeuse propre et ajouter 250 microgrammes de proteinase-K pour chaque 600 microlitres de tampon de lyse. Ajouter ensuite environ 50 microgrammes de RNase A par échantillon et incuber pendant au moins 12 heures à 37 degrés Celsius.
Après l’incubation, ajouter un volume égal d’alcool d’isoamyle chloroforme phénol et bien mélanger. Centrifugez le mélange selon les instructions manuscrites et transférez le supernatant dans un nouveau tube. Ajouter 600 microlitres de chloroforme au supernatant, bien mélanger et centrifugeuses selon les directives manuscrites.
Transférer le supernatant dans un nouveau tube et ajouter 500 microlitres d’isopropanol. Bien mélanger et centrifugeuser à nouveau pour précipiter l’ADN. Après la centrifugation, jeter le supernatant, et laver la pastille d’ADN avec 70% d’éthanol selon les instructions manuscrites.
Séchez complètement la pastille d’ADN, puis, dissolvez-la dans le tampon Tris-HCl. Avant de commencer, préparez les solutions requises et échantillonner le mélange selon les directives manuscrites. Daturez l’échantillon d’ADN en le chauffant à 100 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis placez-le sur la glace.
Coupez la taille appropriée d’une membrane en nylon et rincez-la à l’aide de 6X SSC. Placez la membrane sur un appareil à taches point et connectez la pompe à vide. Repérer les points de six microlitres sur la membrane et hybrider pendant 30 minutes à 80 degrés Celsius.
Ensuite, bloquez la membrane de l’échantillon avec du lait sans gras et de la solution saline tamponnée tris, ou SCT, pendant une heure. Ajouter l’anticorps polyclonal anti-5-hydroxyméthylcytosine à la membrane et incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, laissez la membrane de l’échantillon à température ambiante pendant une heure, puis lavez la membrane trois fois avec le SCT.
Incuber la membrane avec l’anticorps secondaire anti-lapin pendant 30 minutes, puis, laver trois fois avec tbs. Visualiser les signaux de chimioluminescence et quantifier leur intensité. Ce protocole peut être utilisé pour visualiser la 5-hydroxyméthylcytosine, ou 5hmC, dans l’hippocampe des souris adultes.
Immunofluorescence avec des anticorps contre les cellules neuronales, le 5hmC révèle qu’il ya un enrichissement de 5hmC dans les neurones. La dynamique de 5hmC pendant le développement neuronal peut être déterminée avec un essai de point-tache des échantillons d’ADN isolés des cellules souches neurales adultes proliférantes et différenciées. Les niveaux mondiaux de 5hmC augmentent de manière significative pendant la différenciation et le niveau de 5hmC dans les neurones est plus élevé que dans les cellules souches neurales.
L’étape clé de cette méthode est de s’assurer que la dénaturation complète des échantillons d’ADN.
