Ce protocole offre une méthode relativement rapide et rentable, ainsi qu’une acquisition et une analyse automatisées, produisant ainsi un criblage à faible sensibilité de la 5-méthylcytosine qui est un biomarqueur épigénétique commun. Le principal avantage de cette technique réside dans la flexibilité qu’elle offre une conception expérimentale que les utilisateurs peuvent optimiser en fonction de leur modèle et de leur stade de développement. Cette technique peut être utilisée pour détecter comment l’exposition chimique modifie l’abondance relative de la 5-méthylcytosine dans un organisme en développement, ce qui ne pourrait normalement être fait que par des méthodes coûteuses à forte trpA telles que le séquençage.
Cette méthode est utile à toute recherche qui vise à utiliser les méthodes NCG pour comprendre les altérations épigénétiques de la 5-méthylcytosine en réponse à des stimuli environnementaux. Commencez par préparer une solution d’exposition fraîche le matin de la collecte. Ajouter cinq millilitres d’eau du système exempt de particules dans une boîte de Petri en verre de 60 millimètres.
Utilisez ensuite une pipette micro-capillaire en verre de 10 microlitres pour transférer 10 microlitres de diméthylsulfoxyde ou de solution mère chimique dans l’eau du système. Faites tourbillonner la boîte de Petri en verre pour vous assurer que la solution mère se dissipe. Ajouter cinq millilitres supplémentaires d’eau du système à la boîte de Petri en verre et faire tourbillonner la boîte pour homogénéiser la solution d’exposition.
Boucher les plats en verre avec des couvercles en verre pour minimiser l’évaporation. Ensuite, utilisez une bouteille d’eau remplie d’osmose inverse pour transférer les embryons de la fille de poisson dans un plat de 100 millimètres. Triez au hasard 50 embryons vivants 0,75 heure après la fécondation et retirez l’excès d’eau osmosée.
Une fois la durée d’exposition terminée, retirez les embryons de l’incubateur. Transférer tous les embryons vivants dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Aspirer la solution d’exposition résiduelle sans aspirer d’embryons.
Ajouter 500 microlitres de paraformaldéhyde réfrigéré à 4% et mélanger les embryons par inversion plusieurs fois. Laisser les embryons se fixer et 4% de paraformaldéhyde pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Après avoir fixé, les embryons aspirent le paraformaldéhyde à 4%, redépensez les embryons dans 1X PBS et mélangez par pipetage doux pendant 30 secondes.
À l’aide d’une pipette en verre, transférer soigneusement les embryons fixés dans un plat en verre rempli d’eau osmosée. Remuer doucement pendant 30 secondes et répéter ce lavage une fois. Sous un stéréomicroscope réglé à un grossissement de cinq fois, décorer les embryons à l’aide d’aiguilles de seringue.
À l’aide de l’extrémité de l’aiguille, percez le chorion et retirez-le doucement du jaune et de la masse cellulaire. Une fois les embryons décorés, utilisez une micropipette capillaire en verre pour transférer jusqu’à 25 embryons intacts dans un panier d’immunohistochimie. Placez le panier IHC dans une plaque de 24 puits.
Ensuite, aspirez l’eau de chaque puits. Remettez les embryons en suspension dans 500 microlitres de tampon de blocage par puits, enveloppez la plaque avec du paraforme et du papier d’aluminium pour la protéger de la lumière. Incuber la plaque à quatre degrés Celsius pendant quatre heures sur un agitateur orbital à 100 tr / min.
Après l’incubation, aspirez le tampon de blocage de chaque puits. Remplacez-le par 500 microlitres de solution d’anticorps primaires. N’oubliez pas d’incuber un sous-ensemble d’embryons de contrôle de véhicule avec le tampon de blocage pour tenir compte du bruit de fond.
Reconditionnez la plaque, la forme paraforme et la feuille d’aluminium et laissez la plaque incuber à quatre degrés Celsius pendant la nuit sur un agitateur orbital. Le lendemain, retirez la solution d’anticorps primaire de chaque puits et remplacez-la par 1x PBST. Lavez chaque puits trois fois avec 1x PBST pendant cinq minutes par lavage sur un agitateur orbital.
Aspirez 1x PBST de chaque puits et placez le panier IHC dans une boîte de Petri en verre remplie d’eau osmosée. Sous un stéréomicroscope standard, triez au hasard les embryons intacts dans une plaque de 96 puits, assurant un embryon par puits. Ensuite, retirez toute l’eau osmosée des puits individuels et ajoutez 200 microlitres de 1x PBS.
Centrifuger la plaque pendant trois minutes à un G.Image les embryons avec un objectif deux fois sous lumière transmise et FITC. Sélectionnez la mise au point automatique pour vous assurer que la mise au point de l’appareil photo est sur le bas de la plaque et décalée par l’épaisseur inférieure. Sélectionnez une longueur d’onde FITC avec une durée d’exposition de 100 millisecondes et réglez la mise au point automatique sur laser avec un décalage Z.
Observer et confirmer l’acquisition correcte de l’image et de plusieurs puits avant de commencer l’acquisition de plaques. Après l’acquisition de l’image, effectuez l’analyse des données à l’aide du système de filtrage à haut contenu et d’une procédure d’analyse d’image automatisée personnalisée. Sélectionnez chaque embryon sur la plaque de 96 puits à analyser pour la surface totale et l’intensité intégrée de la fluorescence.
Ensuite, tabulez les points de données et exportez-les à partir du système de filtrage à haut contenu en allant sur mesurer et en sélectionnant Open Data log pour exporter les données vers une feuille de calcul. Téléchargez la feuille de calcul exportée dans le package du déployeur pour trier et additionner les données de chaque puits et filtrer par numéro de puits. Utilisez ensuite le bon package Excel pour exporter les données résumées dans une feuille de calcul.
La distribution et l’intensité intégrée de la surface totale spécifique de la 5-méthylcytosine ont été évaluées pour les embryons de poisson zèbre six heures après la fécondation. L’axe des x montre l’exposition au DMSO en tant que véhicule ou au TDCIPP en tant que témoin positif. L’axe des Y indique la fluorescence relative.
Les seuils étaient significativement différents de ceux des embryons traités dans le véhicule, comme le montrent la surface totale de 5-méthylcytosine détectée dans les embryons et l’intensité intégrée dans cette même zone indiquant un rapport signal sur bruit maximal. Il est extrêmement important de maintenir l’intégrité du joug et de la masse cellulaire pour une détection correcte de l’IHC. Cette méthode est relativement peu sensible et n’offre que des données RFU d’abondance relative.
Si une quantification est nécessaire, on peut suivre avec une approche plus ciblée.
