Cette métagénétique grande quantité d’hépatosphères 3D de cellules souches pluripotentes humaines utilisant les matériaux fins et les cellules d’assemblage. La principale avancée de cette technique est qu’elle permet de contrôler la taille des sphères hépatiques 3D, limitant la formation de centres nécrotiques et la perte de phénotype. Yu Wang, post-doctorat dans notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure avec moi.
Préparez-vous à présenter des moisissures agarose en dissolvant deux grammes d’agarose à basse température de fusion dans 100 millilitres d’eau distillée stérilisée. Chauffer délicatement le mélange au micro-ondes avec l’intervalle secouant pour dissoudre complètement l’agarose. Ajouter 520 microlitres de l’agarose fondu à un moule bien formaté 256 et lui permettre de se solidifier.
Ensuite, transférez chaque micro plaque agarose dans un seul puits d’une plaque de 12 puits. Ajouter 1,5 millilitres de DPBS avec du calcium et du magnésium à chaque puits et pipette de haut en bas pour enlever les bulles. Pour préparer la suspension cellulaire, commencez par aspirer le milieu à partir d’une culture indifférenciée de cellules souches pluripotentes humaines, ou CHSLD.
Rincez les cellules en ajoutant cinq millilitres de température ambiante DPBS, calcium, ou magnésium libre, puis retirez le tampon. Ajouter cinq millilitres de réaccente de dissociation cellulaire aux cellules et incuber à 37 degrés Celsius pendant six à huit minutes. Observez le détachement cellulaire au microscope et prolongez l’incubation pendant une ou deux minutes supplémentaires si nécessaire.
Arrêtez la réaction en enlevant le réaccente de dissociation cellulaire et en ajoutant cinq millilitres de MT frais servir un milieu complété par 10 inhibiteur de roche micromolaire, Y27632. Pipette de haut en bas à plusieurs reprises pour dissocier les cellules. Comptez les cellules viables avec l’hémocytomètre et la coloration bleue trypan afin de calculer le nombre total de cellules nécessaires.
Transférer le nombre désiré de cellules dans un tube de centrifugeuse stérile de 15 ou 50 millilitres et une centrifugeuse à 200 fois G pendant cinq minutes pour pelleter les cellules. Jetez le supernatant et suspendez les cellules en MT servir un milieu avec 10 inhibiteurs rocheux micromolaire pour une concentration finale de 2,1 millions de cellules par millilitre. Ensuite, sauver les cellules en ajoutant 190 microlitres de suspension cellulaire préparée par micro puits agarose et l’incubation des micro plaques agarose à 37 degrés Celsius en cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant deux heures.
Après l’incubation, ajouter un millilitre de T frais, chaud, servir un milieu avec inhibiteur de la roche à chaque puits. Retournez les assiettes à l’incubateur et laissez-les là pendant 24 heures. Le lendemain, examinez la sphère de formation.
Préparer des puits recouverts de méthacrylate hydroxyéthyle poly-deux ou poly-héma en dissolvant deux grammes de poly-héma en 100 millilitres de 95 % d’éthanol et en remuant la solution pendant la nuit sur une plaque chaude de 55 degrés Celsius. Le lendemain, ajouter 250 microlitres de la solution à chaque puits d’une assiette de 24 puits et sécher la plaque toute la nuit dans un four de 60 degrés Celsius. Initier la différenciation des hépatocytes en enlevant soigneusement le MT servir un milieu des cellules précédemment ensemencées et en le remplaçant par un millilitre de milieu de différenciation endoderm frais.
Pour les cellules souches embryonnaires humaines, rafraîchir le milieu toutes les 24 heures pendant trois jours. Il est important d’initier la différenciation des hépatocytes 24 heures après l’ensemencement pour éviter la différenciation spontanée des cellules. Après l’induction définitive d’endoderm, passez le milieu au milieu de différenciation d’hépatoblaste pendant cinq jours.
Remplacez le support tous les deux jours, en effectuant le dernier changement le dernier jour de spécification de l’hépatoblaste. Pour transférer les hépatosphères dans les puits recouverts de polyhème préparé, lavez les cellules avec un milieu de maturation des hépatocytes, puis ajoutez un millilitre du milieu complété par 10 nanogrammes par millilitre HGF et 20 nanogrammes par OSM millilitre. Pipette la solution de haut en bas à plusieurs reprises pour soulever les hépatosphères de la micro plaque agarose et les transférer à un puits recouvert de poly-héma.
Laver la micro plaque d’agarose avec un millilitre du milieu de maturation complété des hépatocytes et transférer le milieu au puits recouvert de poly-héma. À l’aide d’une pipette P-100, aspirer soigneusement l’excès de milieu sans enlever les hépatosphères jusqu’à ce qu’il reste environ un millilitre de milieu dans le puits. Rafraîchissez le milieu toutes les 48 heures pendant 12 jours.
Si vous travaillez avec des cellules souches embryonnaires, passez du milieu au milieu d’entretien des hépatocytes au jour 20 en enlevant le milieu de maturation, en lavant les cellules avec un milieu d’entretien, puis en ajoutant un millilitre de milieu d’entretien complété. Après cela, rafraîchir le milieu toutes les 48 heures. Les changements immédiats doivent être effectués avec soin afin d’éviter le stress grave et la distorsion de cette structure sphérique.
La coloration de l’hépatocyte dans les marqueurs mésenchymaux se délecte que les hépatosphères formées à l’aide de cette technique sont composées de cellules hépatocytes entourant un noyau de cellules mésenchymales. D’autres protéines généralement exprimées dans les hépatocytes se trouvent également sur la couche externe des sphères. L’analyse fonctionnelle des enzymes cytochromes P450 ou CYP dans les cultures d’hépatosphère de 30 jours a montré que les sphères 3D affichent des niveaux respectables d’activité CYP par rapport aux hépatocytes primaires humains.
En outre, il peut être démontré que les hépatosphères sécrètent des protéines hépatiques telles que l’albumine et l’alfa-fetoprotéine. La chose la plus importante à retenir pour ce protocole est de pipette doucement de haut en bas de la solution contenant des hépatosphères 3D lors de leur transfert dans la plaque recouverte de poly-héma. Cela permet d’éviter de les endommager.
Une fois maîtrisée, cette méthodologie permet la génération de sphères hépatiques 3D qui restent fonctionnelles pendant plus d’un an in vitro avec de multiples applications dans la modélisation de décès et le dépistage des médicaments. Pour l’avenir, cette technologie pourrait être utilisée comme plate-forme pour développer d’autres tissus entodermaux et mésenchymaux avec des architectures complexes.
