Ce protocole vous permet de générer un grand nombre de cellules T fonctionnelles spécifiques aux antigènes qui sont une approche sûre souhaitée dans le traitement des maladies auto-immunes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle vous fournit un processus de transduction très efficace et un grand nombre de cellules T fonctionnelles. Cette technique peut être étendue pour traiter le diabète de type 1 et d’autres maladies auto-immunes dans lesquelles les antigènes sont connus.
En outre, les cellules T car peuvent être un traitement prometteur pour certains types de cancer. Cette méthode peut être utilisée pour générer des cellules immunitaires exprimant d’autres CRC. Il est important d’avoir une bonne technique acceptée, de lire l’ensemble du protocole et de planifier toute l’expérience à l’avance.
Ce protocole de deux semaines comprend des mini-étapes et le succès dépend de la bonne performance de chaque étape. Les démonstrations visuelles de cette méthode sont essentielles pour que les apprenants suivent correctement. Préparer les cellules phoenix à la transfection telles que décrites dans le manuscrit.
Il est de bonne pratique de marquer la paroi latérale où le milieu sera ajouté et enlevé pour minimiser le soufflage des cellules. Le jour zéro aspirer le surnatant des cellules et les laver avec cinq millilitres de PBS. Ajouter délicatement sept millilitres de sérum réduit moyen dropwise à la paroi latérale de la plaque et transférer les cellules de retour à l’incubateur.
Ajouter 1,5 millilitres de sérum réduit moyen à deux tubes de polypropylène rond de 14 millimètres. Ajouter 40 micromètres de réaccente de transfection à l’un des tubes et 15 microgrammes de plasmide CAR redirigé par anticorps ainsi que cinq microgrammes de plasmide d’emballage à l’autre. Incuber les tubes à température ambiante pendant cinq minutes, puis ajouter le réaccente de transfection au tube plasmide.
Mélanger en pipetant doucement la solution de haut en bas trois fois et l’incuber à température ambiante pendant au moins 20 minutes. Ajouter trois millilitres du mélange aux cellules Phoenix et les placer dans un incubateur de culture tissulaire. Après quatre à cinq heures ajouter un millilitre de FCS aux cellules et les culture pendant la nuit à 37 degrés Celsius.
Le lendemain, retirer le surnatant des cellules et ajouter quatre millilitres de milieu de culture frais préchauré. Récoltez le virus le deuxième jour en recueillant le virus contenant du milieu des cellules Phoenix et en le filtrant pour éliminer les débris cellulaires résiduels. Ajoutez du stock humain recombinant IL-2 au virus pour une concentration finale de 200 unités internationales par millilitre et utilisez-le immédiatement pour la transduction.
Ajouter quatre millilitres de milieu frais aux cellules Phoenix et les placer dans l’incubateur pendant la nuit. Répétez la collecte du virus le lendemain pour une deuxième transduction et jetez les cellules. Un jour avant l’ensemencement des lymphocytes T CD8 murins, ajouter un millilitre d’un mélange d’anticorps anti-souris CD3 et CD28 à chaque puits d’une plaque de puits de 24 et incuber la plaque pendant la nuit à quatre degrés Celsius.
Le jour zéro, récoltez la rate de souris et mettez-les sur une passoire cellulaire trempant dans 10 millilitres de PBS dans un plat de culture cellulaire sur la glace. Dans un capot de culture cellulaire, couper chaque rate en trois à cinq morceaux et utiliser un piston stérile d’une seringue pour presser le tissu à travers le maillage métallique. Retirez doucement les globules rouges en réutilisant les splenocytes dans un à quatre tampons dilués de lyse de globule rouge et en les incubant à température ambiante pendant cinq minutes, puis diluez 10 microlitres de la suspension cellulaire avec Trypan Blue pour le comptage cellulaire.
Et pelleter le reste des cellules en centrifugant à 350 fois g pendant sept minutes. Utilisez un kit d’isolation des lymphocytes T CD8 de souris pour enrichir les lymphocytes T CD8 et suspendre les granulés cellulaires dans 400 microlitres de tampon avec 100 microlitres de cocktail d’anticorps biotine par une fois 10 à la huitième cellule. Bien mélanger la suspension cellulaire et l’incuber pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour permettre la liaison anticorps.
Ajoutez ensuite 300 microlitres de tampon d’étiquetage et 200 microlitres de microbilles anti-biotine par une fois 10 aux huitièmes cellules. Bien mélanger et incuber encore 10 minutes à quatre degrés Celsius. Pendant ce temps, installez une colonne de séparation sur le séparateur et lavez-la avec trois millilitres de tampon d’étiquetage.
Placez une passoire à cellules de 40 micromètres sur le dessus d’une colonne et passez un millilitre du mélange de perles et de cellules à travers la passoire dans la colonne de séparation. Recueillir le flux à travers dans un tube préchilled de 15 millilitres et laver la colonne selon les instructions du fabricant, la collecte des effluents dans le même tube. Comptez les cellules et recueillez-les par centrifugation à 350 fois g pendant cinq minutes.
Lavez-les avec deux millilitres de milieu de cellule T et centrifugeuse à nouveau. Puis les résuspendez dans le milieu préchauré des cellules T à une concentration de 250 000 à 500 000 cellules par millilitre. Lavez trois fois les plaques enduites d’anticorps CD3 et CD28 précédemment préparées avec un millilitre de PBS stérile et ajoutez deux millilitres de suspension cellulaire à chaque puits.
Utilisez un mouvement tourbillonnant pour distribuer les cellules uniformément. En tant que contrôle, plaquez le même nombre de lymphocytes T CD8 dans un seul puits non enduit de la plaque et incubez les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur de réservoir de gaz à dioxyde de carbone de 10 % pendant 48 heures. Le premier jour, préparez des plaques enduites de fragments de fibronectine humaine en ajoutant 0,5 millilitres de fibronectine aux puits d’une plaque de 24 puits et en l’incubant pendant la nuit à quatre degrés Celsius.
Le lendemain, retirez la solution de fibronectine et ajoutez un millilitre de 2%BSA et PBS par puits. Incuber la plaque à température ambiante pendant 30 minutes et laver les puits traités avec un millilitre de PBS stérile. La plaque est prête à l’emploi après avoir enlevé la solution de lavage.
Comptez les lymphocytes T CD8 activés à l’aide de Trypan Blue. Collectez-les par centrifugation. Et les résuspendez à cinq millions de cellules viables par millilitre pour la transduction.
Ajouter 100 microlitres de la suspension cellulaire CD8 activée à chaque puits de la plaque enduite de fibronectine. Ajoutez ensuite 1,5 à deux millilitres du virus précédemment préparé contenant du milieu et mélangez à l’aide d’un mouvement tourbillonnant pour distribuer uniformément les cellules. Sceller la plaque dans un sac Ziploc et la centrifuger à 2000 fois g pendant 90 minutes à 37 degrés Celsius.
Retirez la plaque de la centrifugeuse et emmenez-la dans une armoire de sécurité biologique. Retirez soigneusement le sac en plastique et assurez-vous que l’extérieur de la plaque n’est pas contaminé par un milieu. Transférer la plaque dans un incubateur de dioxyde de carbone de 37 degrés Celsius.
Après quatre heures, retirer un millilitre de milieu de chaque puits, le remplacer par un millilitre de milieu de cellule T complet préchauffé et remettre la plaque dans l’incubateur. Les aspects critiques de ce protocole sont un virus de titer élevé, des cellules T activées saines, et la méthode appropriée de transduction. Les cellules ont été co-tachées avec pe taille sept anti-CD8 conjugués, AF647 conjugué anti-CD3, et BV 421 conjugué anti-CD28 pour l’analyse cytométrique de flux.
Environ 70 % des lymphocytes T CD8 ont co-exprimé le GFP, ce qui indique l’expression de la RCA. Ils ont également co-exprimé CD28 et CD3. Fait important, toutes les cellules positives GFP d’essai ont également co-taché avec des tétramers BR3 d’insuline I-Ag7 qui indique l’expression de la RCA sur la surface de cellules mais pas avec le tétramer de contrôle.
En outre, les cellules T d’essai et de contrôle triées de CAR ont chacune sécrété des niveaux élevés d’interféron gamma seulement après coculture avec les cellules cibles exprimant leurs ligands cognate qui confirme que les cellules transduced ont un phénotype de cellule T effecteur CD8 dirigé vers la cible des anticorps parentaux. La transduction des cellules productrices de virus, l’isolement des lymphocytes T CD8 primaires et l’activation de ces lymphocytes T sont les étapes les plus importantes de cette expérience. Avoir des cellules T activées saines et la transduction de ces cellules T avec des reagents appropriés assure des résultats favorables.
Cette méthode peut être utilisée pour transduire d’autres cellules T, mais elle doit être personnalisée pour le type spécifique de cellule T. Ce protocole ouvre la voie à la prévention du diabète de type 1 avec la thérapie chimène spécifique aux cellules T des récepteurs antigènes chimériques.
