Ce travail a été soutenu par la Fondation allemande pour la recherche (DFG) SCHU-2681 / 1-1 (CS) et KFO 146 (MF), le ministère de la Défense DOD subvention PC 040972 (MO) et l&#39;Institut national de la santé accorde RO1 CA108835 , RO1 Ai44129 (JPS)

1 Production de HLA-A2-Ig Based KaAPC <ol><li> Préparer le tampon de borate stérile. Ajouter une solution 0,1 M d&#39;acide borique dans l&#39;eau et ajuster le pH à 7,0. Filtre stérile (0,22 um) tampon et conserver à 4 ° C. </li><li> Préparer le tampon de lavage des billes stérile. Utiliser une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans calcium et magnésium. Ajouter sérum AB humain pour 3% de concentration finale. Ajouter de l&#39;acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 2 mM de concentration finale. Ajouter de l&#39;azoture de sodium (NaN 3) pour une concentration finale de 0,01%. Filtre stérile (0,22 um) tampon et conserver à 4 ° C. </li><li> Transférer 250 ul de billes époxy (environ 100 x 10 6 billes) en stock dans un stérile, bouchon à vis du flacon de verre. </li><li> Ajouter 250 ul de tampon borate. </li><li> Mettez flacon de verre sur un aimant et laissez perles adhèrent pendant 2 min; tampon aspirer et enlever flacon en verre de l&#39;aimant. </li><li> Lavez perles une fois avec 1 ml de tampon borate. </li><li> Remettre les billes dans 550 pl de 0,018 pg/ Ml HLA-A2-Ig et 3,64 pg / ml d&#39;anticorps anti-CD95 humain mAb (clone CH11) et mélanger doucement en secouant. (S&#39;il vous plaît voir la section de discussion pour plus d&#39;informations.) </li><li> Incuber flacon en verre à une extrémité de la coiffe sur l&#39;extrémité, à 4 ° C pendant 24 heures. </li><li> Isoler perles à 300 g pendant 2 min. </li><li> Placez flacon de verre sur un aimant pendant 2 minutes et aspirer la «solution de chargement KaAPC&quot;; enlever flacon en verre de l&#39;aimant, ajouter 1 ml de tampon de lavage de perles et remettre soigneusement en secouant. </li><li> Répétez l&#39;étape deux fois 1,10. </li><li> Incuber flacon en verre sur un rotateur à 4 ° C pendant 24 h dans 1 ml de tampon de lavage des billes. A ce stade, tous les sites de liaison de protéines résiduel sera bloqué par du sérum AB humain contenu dans le tampon de lavage des billes. </li><li> Isoler perles à 300 g pendant 2 min. </li><li> Lieu flacon en verre sur un aimant pendant 2 minutes et aspirer tampon de lavage de perles; enlever flacon en verre à partir de l&#39;aimant et de remplacer la solution avec 1 ml de PBS. </li></ol> 2 Contrôle de la qualité, le peptide en cours de chargement, Wincinération, stockage, et la stabilité de KaAPC <ol><li> Transférer 1,5 x 10 5 KaAPC dans un tube FACS et laver avec 1 ml FACS tampon de lavage. </li><li> Remettre les billes dans 100 pl de tampon de lavage FACS et ajouter 1 pl d&#39;anti-IgG1 de souris PE (pour la détection de la partie Fc de la molécule HLA-A2-Ig) et 1 pi d&#39;anticorps anti-IgM de souris FITC (clone R6-60.2, pour la détection de l&#39;anticorps monoclonal anti-CD95 humain). </li><li> Incuber pendant 15 min à 4 ° C, laver avec 1 ml FACS tampon de lavage, et remettre en suspension dans 250 ul de tampon de lavage FACS et lire coloration par cytométrie en flux. </li></ol><img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1 QC tache d&#39;un lot KaAPC fait comme indiqué dans la section de protocole. Coloration a été réalisée comme décrit dans la section 2 du protocole HLA-A2-Ig a été détectée en utilisant un anticorps anti-souris-IgG1 mAb PE, alors que l&#39;anti-CD95 humain, (anti-Fas) a été détectée avec un anticorps anti-souris-FITC IgM mAb (voir protocole en soiction 2.2) (ligne bleue). Graphiques noirs pleins représentent billes vides colorées avec un anticorps anti-souris-PE IgG1 ou mAb anti-souris-FITC IgM mAb, respectivement. Numéros dans le coin supérieur droit indiquent l&#39;intensité de fluorescence moyenne (MFI). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <ol start="4"><li> Pour peptide transfert de charge 20 x 10 6 KaAPC dans un nouveau flacon de verre stérile, placer sur un aimant pendant 2 minutes, aspirer PBS et remettre les billes dans 500 ul de PBS frais de 5 ug de peptide (Gardez à l&#39;esprit, les peptides que HLA-A2 restreint sera lier sur le dimère!). </li><li> Magasin chargé KaAPC à 4 ° C jusqu&#39;à l&#39;utilisation, pendant au moins 3 jours pour donner suffisamment de peptide chargement sur le dimère HLA-A2-Ig. </li><li> Immédiatement avant utilisation, lavez le peptide chargé KaAPC comme indiqué dans 1.14; répétez cette étape au moins 6x. NOTE: Il s&#39;agit d&#39;une étape cruciale pour assurer que le peptide libre a to être complètement supprimé pour éviter les faux résultats positifs de mise à mort; peptide libre résiduel a été montré pour induire l&#39;apoptose dans les cultures de cellules T antigène-spécifiques 9. Pour exclure un effet de peptide soluble, exécuter les échantillons de contrôle surnageant de peptide chargé et lavé KaAPC (voir 3.8). </li><li> Comptez perles en utilisant hémocytomètre et étiqueter avec la date, le nom de peptide et de la concentration. REMARQUE: Loaded KaAPC restent fonctionnelles à 4 ° C pendant au moins un mois. Après un mois, le rechargement avec le même peptide permet KaAPC à être utilisé pendant un an. </li></ol> 3. KaAPC Essai in vitro de tuer <ol><li> Préparez le support de co-culture. Préparer un milieu RPMI complet additionné de 3% de T facteur de croissance de cellules (fabriqué au laboratoire 6) donneur et 3% de plasma autologue. Si donneur de plasma autologue n&#39;est pas disponible, utiliser du sérum humain AB inactivé par la chaleur. </li><li> Préparer la liaison préparation tampon AnnexinV. Dissoudre 8,12 g de chlorure de sodium (NaCl) et de 0,12 g calcchlorure de ium (CaCl 2) dans 990 ml ddH 2 O.Add 10 ml de tampon HEPES 1M. </li><li> Générer des cellules T spécifiques de l&#39;antigène humain. (Pour un protocole détaillé s&#39;il vous plaît voir une publication précédente 7 en utilisant des cellules présentatrices de l&#39;antigène artificielles (VAMP)). Assurez-vous que la spécificité de peptide est au moins&gt; 75% tel que déterminé par tétramère coloration. </li><li> Pour chaque échantillon, incuber 2 x 10 5 cellules T spécifiques de l&#39;antigène / puits (dans une plaque à 96 puits à fond rond) dans 200 ul de milieu de co-culture à un ratio de 1: 1 avec KaAPC pendant 48 heures dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Échantillons de récolte et transférer dans un tube FACS; laver avec 1 ml AnnexinV tampon de liaison, centrifuger à 300 g pendant 5 min, éliminer le surnageant et remettre en suspension dans 100 pi de tampon de liaison AnnexinV </li><li> échantillons de taches avec 1 pi AnnexinV FITC et 5 pi 7-AAD pendant 10-15 min à température ambiante, laver avec 1 ml de tampon de liaison AnnexinV; centrifuger à 300 g pendant 5 min, éliminer le surnageant uned remettre en suspension dans un tampon de liaison 250 pi AnnexinV </li><li> Lire immédiatement les échantillons sur cytomètre de flux. </li><li> Préparer les échantillons suivants pour déterminer la destruction spécifique de l&#39;antigène par KaAPC: cellules T seulement; Lymphocytes T anti-CD95 + soluble; Cellules T + déchargés KaAPC; Cellules T + peptide non apparenté chargé KaAPC; Cellules T + peptide apparenté chargé KaAPC; T + surnageant de cellules peptide apparenté KaAPC chargé. </li></ol><img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" width="500" /> . Figure 2 KaAPC dosage tuant peptide chargé KaAPC ou des billes de commande (HLA-A2-Ig seulement perles) ont été cultivées pendant 48 heures à un rapport de 1: 1 avec des cellules CMVpp65 spécifiques de T (~ 80%), récolté et ensuite coloré avec du AnnexinV et l&#39;iodure de propidium (PI) pour déterminer l&#39;apoptose par cytométrie de flux (voir la section 3.3 à 3.7 du protocole). &quot;apparenté&quot; se réfère à des billes chargées de CMVpp65 et «non apparentée» pour êtreannonces chargés de Mart-1 peptide. Les chiffres indiquent le pourcentage de cellules T viables dans le quadrant inférieur gauche de chaque parcelle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <ol start="9"><li> Pour effectuer les expériences s&#39;entrecroisent-, générer des cellules T spécifiques de l&#39;antigène de deux spécificités différentes. </li><li> En outre évaluer les capacités d&#39;appauvrissement spécifique de l&#39;antigène de KaAPC avec une analyse simultanée de l&#39;élimination spécifique d&#39;un antigène des cellules T dans la population hétérogène de cellules T. (Pour un protocole détaillé s&#39;il vous plaît voir Schütz et al. 10). </li></ol>

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	<li>Bizzaro, N., Tozzoli, R., Shoenfeld, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+at+a+stage+to+predict+autoimmune+rheumatic+diseases.">Are we at a stage to predict autoimmune rheumatic diseases.</a> Arthritis and rheumatism. 56 (6), 1736-1744 (2007).</li><li>Sch&#252;tz, C., Oelke, M., Schneck, J. P., Mackensen, A., Killer Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=artificial+antigen-presenting+cells:+the+synthetic+embodiment+of+a+&#8220;guided+missile.">artificial antigen-presenting cells: the synthetic embodiment of a &#8220;guided missile.</a> Immunotherapy. 2 (4), 539-550 (2010).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+but+not+immature+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+human+monocyte-derived+dendritic+cells+are+protected+from+Fas-mediated+apoptosis+and+can+be+used+as+killer+APC.">Mature but not immature Fas ligand (CD95L)-transduced human monocyte-derived dendritic cells are protected from Fas-mediated apoptosis and can be used as killer APC.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 170 (11), 5406-5413 (2003).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+activated+but+not+resting+primary+human+CD4++and+CD8++T+cells+by+Fas+ligand+(FasL/CD95L)-expressing+Killer-dendritic+cells.">Elimination of activated but not resting primary human CD4+ and CD8+ T cells by Fas ligand (FasL/CD95L)-expressing Killer-dendritic cells.</a> Immunobiology. 208 (5), 463-475 (2004).</li><li>Sch&#252;tz, C., Hoves, S., Halbritter, D., Zhang, H. -. G., Mountz, J. D., Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alloantigen+specific+deletion+of+primary+human+T+cells+by+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+monocyte-derived+killer-dendritic+cells.">Alloantigen specific deletion of primary human T cells by Fas ligand (CD95L)-transduced monocyte-derived killer-dendritic cells.</a> Immunology. 133 (1), 115-122 (2011).</li><li>Oelke, M., Maus, M. V., Didiano, D., June, C. H., Mackensen, A., Schneck, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nature. 9 (5), 619-624 (2003).</li><li>Chiu, Y. -. L., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-Ig+based+artificial+antigen+presenting+cells+for+efficient+ex+vivo+expansion+of+human+CTL.">HLA-Ig based artificial antigen presenting cells for efficient ex vivo expansion of human CTL.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (50), (2011).</li><li>Sch&#252;tz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+artificial+antigen-presenting+cells:+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells.">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111 (7), 3546-3552 (2008).</li><li>Snow, A. L., Pandiyan, P., Zheng, L., Krummey, S. M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+and+the+promise+of+restimulation-induced+cell+death+in+human+immune+diseases.">The power and the promise of restimulation-induced cell death in human immune diseases.</a> Immunological reviews. 236 (1), 68-82 (2010).</li><li>Sch&#252;tz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+flow+cytometric+assay+for+the+simultaneous+analysis+of+antigen-specific+elimination+of+T+cells+in+heterogeneous+T+cell+populations.">A new flow cytometric assay for the simultaneous analysis of antigen-specific elimination of T cells in heterogeneous T cell populations.</a> Journal of immunological. 344 (2), 98-108 (2009).</li><li>Shen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=artificial+antigen-presenting+cells+deplete+alloantigen-specific+T+cells+in+a+murine+model+of+alloskin+transplantation.">artificial antigen-presenting cells deplete alloantigen-specific T cells in a murine model of alloskin transplantation.</a> Immunology letters. 138 (2), 144-155 (2011).</li><li>Perica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+artificial+antigen+presenting+Cells+for+T+cell+immunotherapy.">Nanoscale artificial antigen presenting Cells for T cell immunotherapy.</a> Nanomedicine nanotechnology, biology, and medicine. 10 (1), 119-129 (2013).</li><li>Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape+dependence+of+CD8++T+cell+activation+by+artificial+antigen+presenting+cells.">Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells.</a> Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2013).</li></ol>

CS et MF n&#39;ont rien à divulguer. En vertu d&#39;un accord de licence entre NexImmune et de l&#39;Université Johns Hopkins, les Drs. Schneck et Oelke ont droit à des actions de la royauté reçues par l&#39;Université sur les ventes de produits AAPC décrites dans cet article. Ils possèdent également NexImmune actions, qui est soumise à certaines restrictions au titre de la politique de l&#39;Université. Dr Schneck est un membre de la société »du Conseil d&#39;administration et du conseil consultatif scientifique. Les termes de cet arrangement sont gérés par l&#39;Université Johns Hopkins, conformément à son conflit d&#39;intérêts politiques.

L&#39;étape la plus critique dans le protocole est d&#39;assurer le rapport approprié de signaux 1 (peptide CMH) et le signal 2 (anti-Fas mAb). Nous avons effectué des expériences de titrage intensifs à définir le rapport idéal pour le signal 1 et 2; il est devenu évident que des variations minimes en raison de différences dans le dimère HLA-A2 Ig ou concentrations des anti-Fas mAb peuvent interférer avec le fonctionnement du KaAPC. Ainsi, la concentration des deux signaux doit toujours être vérifiée et la qualité des deux protéines doit être testé fréquemment, même si il est ordonné à partir d&#39;une source commerciale. En outre, les concentrations doivent toujours être déterminées par le même essai que différents tests de détection peut résulter en des concentrations différentes. La fonctionnalité de la molécule HLA-A2-Ig peut également être altérée en raison de repliement incomplètes et / ou inefficace peptide chargement. En outre molécules dimères peuvent agréger à des degrés divers, ce qui pourrait avoir un impact sur l&#39;activité fonctionnelle de la protéine. Par conséquent, l&#39;actual quantité de dimère nécessaire pour la génération d&#39;un KaAPC fonctionnel spécifique et peut varier. En outre, nous avons constaté que la gamme idéale pour la mort de signal induisant anti-Fas mAb sur KaAPC est extrêmement serré. Dans nos mains quantités supérieures 3,64 pg / ml conduit à la destruction non spécifique des cellules T Fas positif alors que les montants ci-dessous 3,64 pg / ml ont abouti à une activité de destruction réduit la dose en fonction. Bien que ces conditions semblent assez serré, attention à ces détails se traduira par la création d&#39;un KaAPC fonctionnelle et spécifique. Bien que le phénotype courant KaAPC est fonctionnel pour la déplétion des cellules T activées spécifiques de l&#39;antigène, des expériences initiales ciblant les cellules T spécifiques de l&#39;antigène ou naïves au repos démontré aucune induction significative de l&#39;apoptose spécifique de l&#39;antigène que ces populations ont réduit l&#39;expression de Fas. Par conséquent, on pourrait envisager l&#39;ajout d&#39;un signal de co-stimulation sur le KaAPC pour induire la régulation à la hausse de Fas sur cellules T au repos pour faire tourner lesdans une cible pour la KaAPC. Même si cela est possible les trois signaux devront être titré soigneusement pour assurer un phénotype fonctionnel KaAPC. Réglage de la plate-forme de bourrelet à une matrice biocompatible ou biodégradable améliorera KaAPC en application vivo. Récemment, Shen et al. Ont rapporté le succès de l&#39;utilisation in vivo de KaAPC utilisant des billes 5 um de latex conjuguées à l&#39;anti-Fas (clone Jo2) et anti-His / H2-K b -TRP2 11. Nous avons pu montrer que le concept général de cellules présentatrices de l&#39;antigène artificielles (AAPC) peut être transféré avec succès à partir um dimensionné pour des particules de taille nm 12 et que la fonctionnalité est influencé par la géométrie des particules 13. Ainsi, en faisant varier la taille et / ou la forme de la future KaAPC designs on peut être capable d&#39;avoir un impact sur ​​la fonctionnalité in vivo et la bio-distribution, qui pourrait être essentiel pour la réussite du traitement de maladies auto-immunes spécifiques d&#39;organes. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; KaAPC surmonter les principales faiblesses des stratégies d&#39;épuisement à base de cellules comme un outil facile à utiliser &quot;off the shelf&quot;, le temps et le coût approche efficace qui est indépendante de l&#39;état des bailleurs de fonds et de pré-traitement. KaAPC ne sont pas des cibles de soi ou de signalisation de meurtre paracrine et pas sensible aux fonctions effectrices cytolytiques de CTL. KaAPC nécessitera l&#39;identification de l&#39;antigène de la maladie concernée et compter sur leur type HLA spécifique. Bien qu&#39;actuellement de nombreux antigènes HLA-A2 restreint appropriés pour le diabète de type 1, GvHD et multiples sclérose ont été identifiés 2, le développement de plus HLA de classe I dimère molécules ainsi que l&#39;identification permanente de nouveaux antigènes pertinents auto-immunes va encore accroître et d&#39;élargir l&#39;applicabilité de KaAPC. En outre on pourrait envisager d&#39;utiliser KaAPC réalisé à différents épitopes de cibler des antigènes multiples simultanément. En résumé, KaAPC représentent une technologie de plate-forme flexible pour unespécifiques à Tigen de déplétion des lymphocytes T. Leur nature &quot;lego-like&quot; permet l&#39;inclusion de nouveaux signaux tels que co-stimulation ou d&#39;inhibition supplémentaires tels que PD1 ou TRAIL sur différentes matrices, ce qui pourrait élargir et d&#39;améliorer leur ultérieure in vitro et in vivo applicabilité. Nous présentons ici le protocole étape par étape pour générer KaAPC, l&#39;approche basée sur le premier bourrelet pour l&#39;élimination des cellules T spécifiques de l&#39;antigène à partir de mélanges de cellules T avec des spécificités différentes. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" width="500" /> Figure 3 KaAPC éliminer CTL d&#39;une façon spécifique à l&#39;antigène marqué PKH26 activé Fas + CTL effecteurs mémoire et PKH67 marqué CMVpp65 CTL spécifique du même donneur ont été mélangés à un rapport 1:. Rapport 1 et co-cultivées avec des CMVpp65 KaAPC pendant 48 h. Des cultures témoins ont été traitées avec KaAPC déchargé, ou 1 ug / mldes anti-Fas soluble-mAb (clone CH11). Une perte minimale de cellules viables a été déterminée dans des cultures de CTL mixtes non traités (T mix). Données de FACS originales pour chaque population de CTL du mélange T sont présentés. Analyse de l&#39;apoptose a été effectuée comme précédemment publié par déclenchement séparé des deux populations de cellules T 10. Numbers représentées dans les quadrants supérieur gauche représente% du nombre total de cellules. La figure illustrant est dérivé d&#39;une expérience représentative de trois expériences indépendantes. Cette recherche a été publié à l&#39;origine dans le sang. . Schütz, C. et al tueur Les cellules présentatrices de l&#39;antigène artificielles: une nouvelle stratégie pour supprimer les cellules T spécifiques de sang.. 2008; 111, 3546-52. Droit d&#39;auteur de l&#39;American Society of Hematology. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Au cours des deux dernières décennies, beaucoup de progrès ont été réalisés dans la compréhension des mécanismes pathogènes de maladies auto-immunes. Cependant, les traitements les plus courants comptent encore sur les corticostéroïdes, ainsi que des médicaments immunosuppresseurs tels que les analogues de la purine, des agents alkylants et des inhibiteurs de la calcineurine 1. L&#39;utilisation de ces médicaments a considérablement amélioré le pronostic des patients, mais le traitement ne fournit pas un remède du dysfonctionnement immunologique sous-jacente. En outre, les patients deviennent vulnérables aux infections et au développement d&#39;un cancer. Par conséquent, le but ultime pour le traitement de maladies auto-immunes de cellules T à médiation et le rejet d&#39;allogreffe est de cibler spécifiquement seulement les cellules T provoquant une maladie alors que, en même temps, laissant le système immunitaire restant intacte et compétente pour lutter contre les troubles immunologiques. En utilisant des cellules présentatrices d&#39;antigène (APC) comme un traitement pour supprimer les réponses de cellules T périphériques a été décrite pour la première dèsles années 1970 par plusieurs groupes. Depuis de nombreuses approches à base de cellules ont été développés (revue dans Schütz et al. 2). Stratégies utilisant FasL exprimant killer-APC que les cellules immunomodulatrices ont montré des résultats prometteurs indiquant un potentiel thérapeutique pour le traitement de l&#39;auto-immunité, le rejet d&#39;allogreffe et les infections chroniques. Cependant, il ya des limites importantes des stratégies utilisant FasL Killer-APC qui ont finalement limité leur applicabilité clinique; (I) la production ou l&#39;isolement d&#39;APC est temps, du travail et coûteux (ii) des patients atteints de cytopénie dû à une immunosuppression fournissent des quantités et de la qualité des cellules limitées (iii) le revêtement ou la transduction des APC avec les signaux induisant l&#39;apoptose tels que les résultats de FasL dans très phénotypes variables et (iv) Killer-APC sont sensibles à des fonctions effectrices cytotoxiques de lymphocytes T en réduisant par conséquent leur potentiel thérapeutique. Par conséquent, il est difficile de garantir une reproductibilité phéno Killer-APC définitype qui peut être utilisé pour la modulation spécifique de l&#39;antigène de réponses des lymphocytes T in vivo. Sur la base de nos travaux précédents avec FasL exprimer Killer-APC 3-5 et les cellules présentatrices de l&#39;antigène artificielles (AAPC) 6,7 nous avons développé une approche basée perles (KaAPC) pour l&#39;inhibition ou l&#39;élimination spécifique de l&#39;antigène des cellules T auto-réactifs dans vitro. KaAPC se composent d&#39;un dimère HLA-A2-Ig (signal 1) et un mAb anti-Fas (signal inducteur de l&#39;apoptose) immobilisé de manière covalente sur une surface d&#39;une perle paramagnétique 4,5 um de latex. Ils épuiser les cellules T spécifiques de l&#39;antigène de manière à médiation par Fas / FasL à partir de cultures de multiples spécificités de lymphocytes T de façon spécifique à l&#39;antigène et indépendant de l&#39;activation induite par la mort des cellules (AICD) voie. Dose apoptose dépendante dans les cellules T cibles est rapidement induite déjà après 30 min 8. KaAPC peut être facilement généré de manière contrôlée assurant un défini sur l&#39;étagère phenotype et de surmonter la plupart des lacunes des stratégies d&#39;épuisement à base de cellules. Par conséquent, KaAPC afficher un grand potentiel pour le traitement de maladies auto-immunes de lymphocytes T médiation et le rejet d&#39;allogreffe, faire progresser le domaine des stratégies de traitement de lymphocytes T spécifiques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="654">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:185px;">Name</td>
			<td style="width:157px;">Company</td>
			<td style="width:148px;">Cat #</td>
			<td style="width:164px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human AB serum</td>
			<td>Atlanta biologicals</td>
			<td>S40110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium azide</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M-450 epoxybeads</td>
			<td>Invitrogen/Dynal</td>
			<td>14011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MPC-1 magnet</td>
			<td>Invitrogen/Dynal</td>
			<td>12001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">screw top glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-338AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-CD95 (clone CH11)</td>
			<td>Milliore</td>
			<td>05-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HLA-A2-Ig dimer</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>551263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo-tube 2ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse IgG1 PE</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>559320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse IgM FITC</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>553408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calcium chloride</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES&#160;</td>
			<td>cellgro/Mediatech</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI</td>
			<td>gibco/life technologies</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96well round bottom plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AnnexinV FITC</td>
			<td>PromoKine</td>
			<td>PK-CA577-1001-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7-AAD</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>51-68981E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

killer artificial antigen presenting cells (kaapc) for efficient in vitro depletion of human antigen-specific t cells

Le traitement actuel de cellules T immunes médiées repose essentiellement sur les stratégies d&#39;immunosuppression globale, ce qui, à long terme, est accompagné par des effets secondaires indésirables comme une diminution de la capacité de lutter contre les infections ou les tumeurs malignes. Par conséquent, de nouvelles approches doivent être développées que les cellules cibles que la maladie de médiation et de laisser le système immunitaire reste intact. Au cours de la dernière décennie, une variété de stratégies d&#39;immunothérapie à base de cellules de moduler T à médiation cellulaire réponses immunitaires ont été développés. La plupart de ces approches reposent sur des cellules présentatrices d&#39;antigènes induisant une tolérance (APC). Cependant, en plus d&#39;être techniquement difficile et encombrant, de telles approches à base de cellules sont très sensibles aux réponses des cellules T cytotoxiques, ce qui limite leur capacité thérapeutique. Ici, nous présentons un protocole pour la génération de cellules présentatrices de l&#39;antigène artificielles tueuses non cellulaire (KaAPC), ce qui permet la déplétion des cellules T pathologiques tout en laissant la resystème immunitaire restant intact et fonctionnel. KaAPC est une solution alternative à l&#39;immunothérapie cellulaire qui a un potentiel pour le traitement de maladies auto-immunes et les rejets d&#39;allogreffes par la régulation des réponses des cellules T indésirables d&#39;une manière spécifique de l&#39;antigène.

Les caractéristiques de ce protocole comprennent la génération définie d&#39;un phénotype KaAPC qui affiche HLA-A2-Ig (signal 1) et anti-Fas mAb (signal d&#39;apoptose) en même temps, ce qui par rapport à des approches à base de cellules n&#39;est pas modifiée par revêtement ou des efficacités de transduction et peut être facilement modulés lors de la fabrication (figure 1). En outre, KaAPC, ne sont pas sensibles à des fonctions effectrices cytotoxiques des cellules T et leur fonction ne dépend pas de la qualité de cellules présentatrices d&#39;antigènes autologues avant et après la manipulation in vitro. KaAPC sont capables d&#39;épuiser les cellules T spécifiques de l&#39;antigène in vitro, lorsqu&#39;elles sont chargées avec le peptide apparenté, tandis que les non-apparenté chargé KaAPC sera pas épuiser les cellules T (figure 2). Par conséquent, KaAPC induire l&#39;apoptose des cellules T d&#39;une manière spécifique de l&#39;antigène. Par la suite, nous avons utilisé pour KaAPC déplétion sélective des cellules T spécifiques de l&#39;antigène à partir d&#39;un mélange de différents spe des lymphocytes Tcificities, démontrant que seule la cytotoxicité minimale fuyait dans les cellules voisines T (figure 3). Ainsi, KaAPC représentent un outil exquise pour déplétion in vitro spécifique d&#39;un antigène des cellules T spécifiques de l&#39;antigène humains activés par application clinique potentielle pour le traitement de maladies auto-immunes et les rejets d&#39;allogreffes.

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Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Lignes directrices sont présentées pour la production de l&#39;antigène artificiel de tueur des cellules présentatrices, KaAPC, un outil efficace pour la déplétion in vitro de lymphocytes T spécifiques de l&#39;antigène humain et une solution alternative à l&#39;immunothérapie cellulaire pour le traitement de T maladies auto-immunes à médiation cellulaire à un antigène de façon spécifique sans compromettre le système immunitaire reste.

Tueur antigène artificielle cellules présentatrices (KaAPC) d&#39;utilisation efficace<em&gt; In Vitro</em&gt; L&#39;épuisement des lymphocytes T humains spécifiques de l&#39;antigène

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

killer-artificial-antigen-presenting-cells-kaapc-for-efficient-vitro

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

9.6K vues.  Johns Hopkins University.  Lignes directrices sont présentées pour la production de l'antigène artificiel de tueur des cellules présentatrices, KaAPC, un outil efficace pour la déplétion in vitro de lymphocytes T spécifiques de l'antigène humain et une solution alternative à l'immunothérapie cellulaire pour le traitement de T maladies auto-immunes à médiation cellulaire à un antigène de façon spécifique sans compromettre le système immunitaire reste. 

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Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation. This labeling has classically been used to study proliferation and migration. In the method presented here, we have shortened the timeline after adoptive transfer to look at survival and killing of epitope specific CFSE labeled target cells4-6. The level of specific killing of a CD8 + T cell clone can indicate the quality of the response, as their quantity may be misleading. Specific CD8+ T cells can become functionally exhausted over time with a decline in cytokine production and killing7,8. Also, certain CD8 + T cell clones may not kill as well as others with differing TCR specificities9. For effective Cell Mediated Immunity (CMI), antigens must be identified that produce not only adequate numbers of responding T cells, but also functionally robust responding T cells. Here we assess the percent cell specific killing of two peptide specific T cell clones in BALB/c mice.

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Many infections elicit a strong CTL response, but occasionally, the quantity of responding cells does not correlate to control of the pathogen1. One measure of CTL quality is their ability to kill specifically2. CFSE labeling of target cells can be used to investigate this CTL response quality in vivo3,4.

Specific Antigen In Vivo</emTuer Assay> en utilisant des cellules CFSE cible marquée

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

Recherche

Immunologie et infection

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals may exhibit suppressive immune microenvironment and, in contrast to activating CTL, their autologous antigen presenting cells may tend to tolerize or anergize antigen specific CTL. As a result, although still in the experimental phase, CTL-based adoptive immunotherapy has evolved to become a promising treatment for various diseases such as cancer and virus infections. In initial experiments ex vivo expanded CMV (cytomegalovirus) specific CTL have been used for treatment of CMV infection in immunocompromised allogeneic bone marrow transplant patients. While it is common to have life-threatening CMV viremia in these patients, none of the patients receiving expanded CTL develop CMV related illness, implying the anti-CMV immunity is established by the adoptively transferred CTL1. Promising results have also been observed for melanoma and may be extended to other types of cancer2. 
While there are many ways to ex vivo stimulate and expand human CTL, current approaches are restricted by the cost and technical limitations. For example, the current gold standard is based on the use of autologous DC. This requires each patient to donate a significant number of leukocytes and is also very expensive and laborious. Moreover, detailed in vitro characterization of DC expanded CTL has revealed that these have only suboptimal effector function 3. 
Here we present a highly efficient aAPC based system for ex vivo expansion of human CMV specific CTL for adoptive immunotherapy (Figure 1). The aAPC were made by coupling cell sized magnetic beads with human HLA-A2-Ig dimer and anti-CD28mAb4. Once aAPC are made, they can be loaded with various peptides of interest, and remain functional for months. In this report, aAPC were loaded with a dominant peptide from CMV, pp65 (NLVPMVATV). After culturing purified human CD8+ CTL from a healthy donor with aAPC for one week, CMV specific CTL can be increased dramatically in specificity up to 98% (Figure 2) and amplified more than 10,000 fold. If more CMV-specific CTL are required, further expansion can be easily achieved by repetitive stimulation with aAPC. Phenotypic and functional characterization shows these expanded cells have an effector-memory phenotype and make significant amounts of both TNF&alpha; and IFN&gamma; (Figure 3).

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

A new DC independent method for induction and expansion of antigen-specific T cells is described. HLA A2-Ig based artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) are loaded with HLA-A2 restricted peptides to efficiently expand CTL of diverse antigen specificity. This technology holds great potential for CTL-based adoptive immunotherapy.

HLA-Ig des cellules à base Antigène artificielle Présentation d&#39;Efficient Ex vivo Extension du CTL humaines

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike classical T cells, NKT cells recognize lipid antigen in the context of CD1 molecules2. NKT cells express an invariant TCR&alpha; chain rearrangement: V&alpha;14J&alpha;18 in mice and V&alpha;24J&alpha;18 in humans, which is associated with V&beta; chains of limited diversity3-6, and are referred to as canonical or invariant NKT (iNKT) cells. Similar to conventional T cells, NKT cells develop from CD4-CD8- thymic precursor T cells following the appropriate signaling by CD1d 7. The potential to utilize NKT cells for therapeutic purposes has significantly increased with the ability to stimulate and expand human NKT cells with &alpha;-Galactosylceramide (&alpha;-GalCer) and a variety of cytokines8. Importantly, these cells retained their original phenotype, secreted cytokines, and displayed cytotoxic function against tumor cell lines. Thus, ex vivo expanded NKT cells remain functional and can be used for adoptive immunotherapy. However, NKT cell based-immunotherapy has been limited by the use of autologous antigen presenting cells and the quantity and quality of these stimulator cells can vary substantially. Monocyte-derived DC from cancer patients have been reported to express reduced levels of costimulatory molecules and produce less inflammatory cytokines9,10. In fact, murine DC rather than autologous APC have been used to test the function of NKT cells from CML patients11. However, this system can only be used for in vitro testing since NKT cells cannot be expanded by murine DC and then used for adoptive immunotherapy. Thus, a standardized system that relies on artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) could produce the stimulating effects of DC without the pitfalls of allo- or xenogeneic cells12, 13. Herein, we describe a method for generating CD1d-based aAPC. Since the engagement of the T cell receptor (TCR) by CD1d-antigen complexes is a fundamental requirement of NKT cell activation, antigen: CD1d-Ig complexes provide a reliable method to isolate, activate, and expand effector NKT cell populations.

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Here we describe a method for activating and expanding human NKT cells from bulk T cell populations using artificial antigen presenting cells (aAPC). The use of CD1d-based aAPC provides a standardized method for generating high numbers of functional NKT cells.

Présentatrice d&#39;antigène artificielle d&#39;activation à médiation cellulaire (AAPC) et l&#39;expansion des cellules T tueuses naturelles

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

Application clinique de<em&gt; Belle au Bois Dormant</em&gt; Et artificielle cellules présentatrices d&#39;antigènes pour modifier génétiquement des cellules T du sang de cordon ombilical et périphériques

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

Développement d&#39;un modèle Colite antigène conduit à étudier la présentation des antigènes par les cellules présentatrices d&#39;antigènes aux cellules T

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Générateur<em&gt; De Novo</em&gt; Spécifiques de l&#39;antigène T Human cellulaires Receptors par rétrovirale transduction de Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

Développement de cellules souches dérivées de cellules T régulatrices spécifiques de l&#39;antigène contre Autoimmunité

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

Génération de discriminatif anticorps monoclonaux humains de cellules rares spécifiques de l’antigène B circulant dans le sang

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The development of stable, non-toxic, fluorescent dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) allows for rare, antigen-specific T cells to be distinguished from bystanders by diminution in fluorescent staining, as detected by flow cytometry. This method has the following advantages over alternative approaches: (i) it is very sensitive to low-frequency T cells, (ii) no knowledge of the antigen or epitope is required, (iii) the phenotype of the responding cells can be analyzed, and (iv) viable, responding cells can be sorted and used for further analysis, such as T cell cloning.

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Presented here is a protocol for measuring proliferating CD4+ T cells in response to antigenic proteins or peptides using dye dilution. This assay is particularly sensitive to rare antigen-specific T cells and can be modified to facilitate cloning of antigen-specific cells.

Quantification de la prolifération des cellules CD4et T spécifiques à l'antigène humain à l'aide de Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the spontaneous non-obese diabetes (NOD) mouse model, insulin is the primary target, and genetic manipulation of these animals to remove a single key insulin epitope prevents disease. Thus, selective elimination of professional antigen presenting cells (APCs) bearing this pathogenic epitope is an approach to inhibit the unwanted insulin-specific autoimmune responses, and likely has greater translational potential.
Chimeric antigen receptors (CARs) can redirect T cells to selectively target disease-causing antigens. This technique is fundamental to recent attempts to use cellular engineering for adoptive cell therapy to treat multiple cancers. In this protocol, we describe an optimized T-cell retrovirus (RV) transduction and in vitro expansion protocol that generates high numbers of functional antigen-specific CD8 CAR-T cells starting from a low number of naive cells. Previously multiple CAR-T cell protocols have been described, but typically with relatively low transduction efficiency and cell viability following transduction. In contrast, our protocol provides up to 90% transduction efficiency, and the cells generated can survive more than two weeks in vivo and significantly delay disease onset following a single infusion. We provide a detailed description of the cell maintenance and transduction protocol, so that the critical steps can be easily followed. The whole procedure from primary cell isolation to CAR expression can be performed within 14 days. The general method may be applied to any mouse disease model in which the target is known. Similarly, the specific application (targeting a pathogenic peptide/MHC class II complex) is applicable to any other autoimmune disease model for which a key complex has been identified.

This article describes a protocol for the generation of antigen-specific CD8 T cells, and their expansion in vitro, with the aim of yielding high numbers of functional T cells for use in vitro and in vivo.

Génération à haut rendement de cellules T cytotoxiques cytotoxiques de souris primaires spécifiques à l'antigène pour les tests fonctionnels dans un modèle de diabète auto-immun

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...