Un des principaux avantages de cette technique pour caractériser les transporteurs membranaires est que vous pouvez déterminer l’affinité relative du transporteur pour des substrats spécifiques, ainsi que d’obtenir un aperçu sur le mécanisme de transport. La caractérisation des protéines membranaires qui utilisent des gradients protéiques pour stimuler le transport du substrat est particulièrement adaptée à cet essai de vésicule à l’intérieur que nous démontrons ici. Bien que cet essai nécessite certains équipements spécialisés tels qu’une presse Français et l’accès à une ultracentrifugeuse, nous pensons qu’il peut être techniquement plus facile que les analyses qui nécessitent des transporteurs membranaires pour être reconstitués en liposomes artificiels.
Le principal avantage de cette technique est qu’elle nous permet de quantifier les affinités relatives pour différents substrats et de faire des essais de compétition pour tester l’effet des substrats concurrents sur les grilles de transport. Dans le cas du transporteur BAT1 utilisé pour illustrer cet essai, nous avons également pu montrer l’activation du substrat du transporteur par arginine. Pour commencer cette procédure, cultivez les cellules mutantes préparées d’E.coli qui expriment la protéine cible en inoculant une seule colonie en cinq millilitres de polyamine 3 médias avec des antibiotiques appropriés et en la cultivant pendant la nuit à 37 degrés Celsius.
Le lendemain, transférez cette culture à 500 millilitres de polyamine fraîche 3 médias qui est complétée par 0,0002%arabinose et se développent jusqu’à ce que la culture cellulaire atteint un OD600 entre 0,6 et 0,8. Après cela, centrifugeuse à 2000 fois G et à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes pour recueillir la pastille cellulaire. Suspendez le granulé et lavez-le trois fois avec le tampon un en centrifugant à 2000 fois G et à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes à chaque fois.
Le volume final de cellules dans buffer un après le troisième spin doit être de 10 millilitres. Mettez en place une cellule Français de pression de 35 millilitres et versez la suspension cellulaire dans le corps de la cellule. Allumez la machine avec l’interrupteur sur le RHS à l’arrière de l’appareil et réglez le commutateur de sélecteur de rapport à haut.
Allumez la pompe. Le piston commencera à s’élever de la base pour déplacer l’air dans la chambre. Augmentez la pression en tournant la soupape d’augmentation de pression dans le sens des aiguilles d’une montre jusqu’à ce que la jauge atteigne 640 PSI.
Ça créera une pression interne de 10 000 PSI. Une fois que la cellule a atteint la pression cible, ouvrez légèrement l’assemblage de la valve d’écoulement en la retournant dans le sens inverse des aiguilles d’une montre. Ajustez l’ouverture de la vanne pour permettre un débit d’environ 10 gouttes par minute.
Lorsque la ligne d’arrêt sur le corps du piston atteint le sommet de la cellule d’écoulement éteindre la pompe. Abaissez la plaque inférieure en plaçant le commutateur sélecteur de rapport vers le bas, puis, en mettant l’interrupteur de la pompe allumé. Lorsque la plaque inférieure est complètement rétractée, réduisez la pression du système à zéro en tournant la soupape d’augmentation de pression complètement dans le sens inverse des aiguilles d’une montre.
Éteignez la pompe et éteignez la machine. Centrifugeuse Français presse à 10 000 fois G et à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes pour enlever les cellules ininterrompues et les débris cellulaires. Jeter la pastille et transférer le supernatant dans des tubes d’ultracentrifugeuse.
Ultracentrifugeuse le supernatant résultant à 150.000 fois G et à quatre degrés Celsius pendant une heure pour pelleter les vésicules membranaires. Laver les vésicules membranaires une fois sans re-suspension dans le tampon deux. Ensuite, utilisez un broyeur de tissu Dounce pour suspendre à nouveau les vésicules membranaires dans le tampon deux.
Préparez 100 microlitres aliquots des préparations membranaires dans des tubes de centrifugeuse de 1,5 millilitre et conservez-les à moins-80 Degrés Celsius. Tout d’abord, laver et suspendre à nouveau les vésicules dans 30 millimolaires de Tris au pH 7,8, qui contient 0,1 millimolaire de chlorure de cobalt II. Ajouter un microlitre de carboxypeptidase A en chlorure de sodium, tris et chlorure de cobalt II à chaque échantillon de 100 microlitres.
Incuber à 20 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ajouter cinq microlitres d’une solution contenant de l’EDTA de sodium et du 2-Mercaptoéthanol à PH 7,5 pour arrêter la digestion. Incuber la solution à température ambiante pendant une heure pour inactiver complètement l’enzyme.
Ensuite, ajoutez entre cinq et 10 microlitres d’une solution contenant du sulfate de dodédecyl au lithium, du glycérol, du bromophénol bleu et du Tris au pH 7,5 à 100 microlitres de l’échantillon et analysez des échantillons par électrophorèse. Pour effectuer le buvard d’acides aminés, déposer un filtre à nitrocellulose humidifié avec du phosphate d’hydrogène de sodium de 25 millimlaires sur le gel de polyacrylamide. Placez-les entre deux filtres à cellulose humidifiés, et enfin, entre deux tampons d’affouillement en plastique humidifiés.
Placez cet assemblage entre les électrodes d’une chambre contenant du phosphate d’hydrogène de sodium de 25 millimlaires à une température comprise entre deux et quatre degrés Celsius. Électrotransférer les protéines à 20 volts et à deux à trois amplis pendant trois heures. Bloquez la membrane de nitrocellulose en bloquant le tampon pendant la nuit à deux degrés Celsius.
Le lendemain, incuber la nitrocellulose à 20 millilitres de une à 5000 dilution de l’anticorps HRP anti-son terminal C et bloquer le tampon pendant deux heures et laver deux fois avec 50 millilitres de tampon pour un total de 60 minutes. Pour visualiser la tache d’aminé, dissoudre six milligrammes de 4-Chloro-1-naphthol en 20 millilitres d’alcool dénaturé et ajouter 80 millilitres de Tris de 15 millimolaires et 50 microlitres de peroxyde d’hydrogène à 30%. Baignez le papier filtre dans cette solution de substrat pendant 20 minutes.
Lorsque suffisamment de couleur s’est développée, rincer la membrane à l’eau et la laisser sécher. Pour commencer, incuber les 100 microlitres aliquot des vésicules membranaires à 12 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ajouter le tampon 3 contenant des polyamines radioétiques à une concentration finale de 50 micromolaires aux vésicules membranaires dans des tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitres pour initier le transport.
Effectuez l’analyse de transport à 12 degrés Celsius pendant une minute. Après cela, transférez les mélanges de réaction au collecteur de filtration et filtrez-le par un filtre à membrane nitrocellulose de 0,45 micromètre. Ajouter trois millilitres de tampon d’essai glacé contenant une concentration dix fois plus élevée de polyamines non étiquetées, suivie de trois millilitres de tampon d’essai sans les polyamines pour réduire la liaison non spécifique.
Transférer les filtres lavés sur des flacons jetables de scintillation de 20 millilitres contenant 10 millilitres de liquide de scintillation et utiliser un compteur de scintillation liquide pour déterminer la radioactivité. Calculer l’absorption nette de polyamine tel qu’il est décrit dans le protocole textuel. Déterminer le km pour le substrat en mesurant l’absorption du substrat radioétique dans les vésicules exprimant la protéine cible et calculer la cinétique Michaelis-Menten à l’aide d’une méthode de régression non ligneaire.
Pour les expériences de compétition, ajouter le substrat concurrentiel non étiqueté fabriqué dans le tampon d’essai au tube de centrifugeuse contenant 100 microlitres de vésicules à 12 degrés Celsius tout en ajoutant simultanément 50 micromolaires de la polyamine radiolabellisé. Mesurer la radioactivité emprisonnée à l’intérieur des vésicules comme décrit précédemment. Déterminer un KM parent pour les substrats compétitifs en mesurant l’absorption des polyamines radioétiques et la présence de substrat non étiqueté de 100 micromolaires ou plus et utiliser une méthode de régression non ligneux pour tracer la courbe.
Dans cette étude, un anti-porteur se caractérise par l’expression d’abord de la protéine dans E.coli, puis, la génération de vésicules membranaires de sorte que la protéine exprimée heterologously peut être analysée dans un système sans cellules. Une tache occidentale est utilisée pour vérifier qu’AtBAT1 est translocalisé en vésicule. Sonder la tache avec un anticorps anti-son C-terminal a indiqué une protéine de construction de fusion qui est approximativement 72.3 kilodaltons.
La digestion des vésicules avant SDS-PAGE a entraîné une diminution, mais pas une perte complète du signal de la sonde. À 12 degrés Celsius, l’absorption d’une spermidine radioétique par les vésicules est la plus élevée à une minute et est restée linéaire pendant trois minutes. Par conséquent, le temps d’incubation de l’analyse de transport est fixé à une minute.
Après une minute, il n’y a pas d’absorption nette d’isotopes par les vésicules membranaires qui ont été préparées et stockées au pH 8.0 car il n’y a pas de gradient de protons à travers la membrane vésicule. Pour démontrer l’effet de la dissipation du gradient artificiel des protons, les vésicules membranaires sont incubées en tampon pH 8.0 pendant 10 minutes avant l’ajout d’un substrat étiqueté, ce qui entraîne une absorption minimale du substrat radioétique. Pris ensemble, ces résultats indiquent que l’absorption de spermidine par proton est due à la protéine BAT1.
Pour déterminer la spécificité du substrat de la protéine, les valeurs km sont calculées en mesurant l’absorption du substrat radioétique à différentes concentrations. Les valeurs km pour la spermidine, la putrescine et l’arginine indiquent que cette protéine est un échangeur de polyamine et d’arginine de haute affinité. L’affinité du transporteur pour un substrat particulier peut également être déterminée indirectement en utilisant des analyses de concurrence.
Ces analyses révèlent que GABA est un inhibiteur compétitif de la spermidine. En outre, la mesure de l’absorption de 50 micromolaires de spermidine radiolabeled en présence de concentrations variables de différents acides aminés révèle qu’AtBAT1 est également capable de transporter le glutamate et l’alanine à des concentrations millimolaires. Lors de l’exécution de cette procédure, l’intégration du transporteur membranaire dans la membrane bactérienne est, évidemment, critique.
La vérification que la protéine d’intérêt est intégrée dans la membrane peut être effectuée à l’aide d’anticorps dirigés contre les étiquettes du terminal C. La variation génétique des transporteurs humains peut affecter le transport, à la fois, de métabolites et de médicaments qui sont des substrats du transporteur particulier. Ainsi, la variation allélique peut affecter, à la fois, l’absorption et l’excrétion des médicaments.
De nombreuses variantes alléliliques peuvent être rapidement faites par mutagenèse latérale du gène transporteur dans un vecteur d’expression. Les analyses fonctionnelles de ces variantes peuvent ensuite être testées dans des conditions très contrôlées à l’aide d’analyses vésicules à l’intérieur. Les transporteurs membranaires constituent de huit à dix de toutes les protéines et la majorité n’ont pas été caractérisés complètement dans aucun des organismes modèles.
Les transporteurs qui sont localisés aux membranes organelles sont particulièrement difficiles à caractériser par l’expression heterologous dans les cellules eucaryotes. Si le type d’échange ou les transporteurs à base de protons peuvent être localisés à cette membrane E.coli, ces transporteurs peuvent être caractérisés fonctionnellement à l’aide de cet essai in vitro. La qualité et le rendement des vésicules sont affectés par le taux d’élitution des fragments de cellules de la Français presse.
En faisant des analyses de transport de vésicules avec des isotopes, il est important d’avoir une configuration expérimentale qui facilite faire des répliques expérimentales. Il y a plusieurs façons de le faire, mais nous pensons qu’il nous sera utile de vous montrer comment nous l’avons fait.
