Dans cette vidéo, nous démontrons comment exprimer les constructions d’ADN exogène dans les neurones optiques et comment imager les tonnelles axonales optiques individuelles exprimant GFP dans des têtards Xenopus laevis intacts et vivants. Il s’agit d’une procédure simple et peu coûteuse pour la transgenèse spécifique aux cellules transitoires qui permet de déterminer la fonction du gène autonome cellulaire dans les tonnelles axonales optiques individuelles, se développant dans un système vivant de modèle vertébré. Sophia Dao, adjointe à la recherche, et Tamira Elul, chercheuse principale du laboratoire, démontreront la procédure.
Pour commencer, coupez doucement la pointe d’une pipette micro capillaire en verre tiré avec des forceps fins. Remplissez la pipette en verre micro capillaire avec de l’huile minérale à l’aide d’un MICROFIL de sorte qu’une petite goutte d’huile minérale apparaît à l’extrémité coupée de la micro pipette. Remplir la pipette micro capillaire en verre à mi-chemin avec de l’huile minérale.
Dans un injecteur, éjecter le piston à mi-chemin et charger la pipette micro capillaire en verre tiré dans le support d’injection. Puis étendre le piston dans toute la mesure pour confirmer que la pipette micro capillaire est fortement attaché à l’injecteur et ne se déplace pas avec l’extension du piston. Transférer une goutte de trois microlitres du mélange ADN/DOTAP sur une feuille carrée d’un pouce de papier paraffine.
Sous un microscope à disséquer stéréo, déplacez la pointe de la pipette micro capillaire en verre dans la goutte d’ADN/DOTAP. Utilisez l’option de remplissage sur l’appareil d’injection, sucer lentement l’ADN / DOTAP tomber dans la pipette en verre micro capillaire. La frontière entre l’huile minérale et la solution ADN/DOTAP est visible dans la pipette micro capillaire en verre en raison de la légère opacité de la solution ADN/DOTAP.
Si nécessaire, arrêtez de remplir périodiquement la pipette micro capillaire pour permettre à la pression dans la pipette micro capillaire en verre de recalibrer. Tout d’abord, dans une boîte petri de 10 millilitres remplie de 0,1 X MMR, dé-vitellinize manuellement 10 stade 20 à 24 embryons Xenopus avec des forceps fins. Saisissez l’enveloppe vitelline à la taille pour éviter de blesser les embryons.
Avec des forceps dans la main gauche et droite de l’expérimentateur, pop la bulle de l’enveloppe vitelline et libérer l’embryon de l’enveloppe vitelline. Prenez soin de ne pas blesser les embryons lors de l’enlèvement de l’enveloppe vitelline. Ensuite, utilisez une pipette de transfert en plastique avec une pointe coupée pour transférer cinq à 10 embryons de stade dé-vitellinized 22 à 24 à une boîte de Petri de 10 millilitres remplie de 1X MMR.
Sous un microscope stéréo, saisir l’un des embryons dé-vitellinized dans la boîte de Petri avec des forceps et organiser l’embryon de sorte que son pôle antérieur est pointé vers le haut dans le champ de vision. Orientez ensuite l’embryon de façon à ce qu’il soit couché latéralement et qu’un de ses bourgeons oculaires de gauche à droite soit orienté vers le haut. Tenez l’embryon avec les forceps dans la main non dominante de l’expérimentateur et avec la main dominante de l’expérimentateur, introduisez la pointe de la micro pipette en verre du côté ventral ou dorsal juste sous l’épiderme dans le bourgeon d’oeil.
Injectez entre 70 et 210 nanolitres de la solution ADN/DOTAP. Ensuite, retournez l’embryon et effectuez la même micro-injection dans l’autre bourgeon oculaire du côté contralatéral de l’embryon. Injecter les deux bourgeons oculaires de six à 10 embryons dans chaque expérience.
Après micro-injection, conserver les embryons dans une boîte de Pétri avec 1X MMR pendant environ 30 minutes pour faciliter la cicatrisation des plaies. Après 30 minutes, transférer les embryons injectés avec une pipette de transfert en plastique dans une solution 0.1X MMR avec 0.001%agent de blanchiment phenylthiocarbamide pour réduire la pigmentation. Couvrir la boîte de Pétri d’un couvercle pour la culture des embryons pendant environ cinq jours jusqu’à ce que les embryons se soient développés en têtards aux stades 46 à 47.
Ce protocole donne un taux de réussite de 30 à 60% des embryons Xenopus injectés exprimant GFP dans une à 10 tonnelles axonales optiques. Des images confoccales représentatives de GFP montrent le contrôle d’expression et les tonnelles axonales optiques mutantes dans les têtards Xenopus intacts. Deux mutants de domaine d’APC, D’APCNTERM, et d’APBbeta-chat ont été clonés dans les plasmides de pCS2.
Des images de la série Z du contrôle de GFP et des tonnelles axonales optiques mutantes d’APC ont été reconstruites. Des parcelles de nombre de branches, la longueur totale de la branche arboricole et la longueur moyenne des branches confirment les différences observées entre le contrôle et le mutant APC exprimant des tonnelles axonales. Des diagrammes de dispersion supplémentaires du nombre de branches par rapport à la longueur moyenne des branches avec des lignes de régression montrent une corrélation inverse entre ces paramètres et les tonnelles axonales optiques exprimant les domaines APC.
La pointe de la pipette micro capillaire doit être correctement insérée très superficiellement dans le bourgeon oculaire de sorte que l’épiderme gris qui gonfle le bourgeon oculaire gonfle au cours de chaque micro injection. Cette procédure peut être utilisée à la fois pour étiqueter et modifier la fonction génétique spécifique dans les neurones optiques tout en évaluant la croissance, le ciblage et la ramification des axones de ces neurones optiques. Cette technique de micro-injection et de lipofection de l’ADN a permis aux chercheurs en neurobiologie développementale d’étudier les mécanismes moléculaires autonomes cellulaires qui régulent l’arboration de l’axon optique dans les têtards Xenopus laevis intacts et vivants.
