このビデオでは、光学ニューロンにおける外因性DNA構築物を発現する方法と、個々のGFP発現型視軸索アーバーを無傷で生きているゼノプス・レービス・オタマジャクシで画像化する方法を示しています。これは、個々の視軸索樹木における細胞自律遺伝子機能の決定を可能にする一過性細胞特異的トランスジェネシスのための安価で簡単な手順であり、生きている脊椎動物モデルシステムで発症する。この手順を実証することは、私、ソフィア・ダオ、リサーチ・アシスタント、そしてラボ主任研究者のタミラ・エルル博士です。
まず、引っ張られたガラスのマイクロキャピラリーピペットの先端を細かい鉗子でそっとクリップします。マイクロフィペットの切り取った先端に小さな鉱物油が現れるようなマイクロフィルを使用して、ガラスマイクロキャピラリーピペットにミネラルオイルをバックフィルします。ガラスマイクロキャピラリーピペットの中途半端にミネラルオイルを入れます。
インジェクタで、プランジャーを途中で排出し、引っ張られたガラスのマイクロキャピラリーピペットを注入ホルダーにロードします。次に、プランジャーを全範囲まで延長して、マイクロキャピラリーピペットがインジェクタに強く取り付けられ、プランジャーの延長と一緒に移動しないことを確認します。3マイクロリットルのDNA/DOTAP混合物を1インチ平方シートのパラフィン紙に移します。
ステレオ解剖顕微鏡の下で、ガラスマイクロキャピラリーピペットの先端をDNA/DOTAPドロップに移動します。注入装置の充填オプションを使用して、ゆっくりとガラスマイクロキャピラリーピペットにDNA/DOTAPドロップを吸い込みます。DNA/DOTAP溶液のわずかな不透明度により、ガラスマイクロキャピラリーピペットに鉱物油とDNA/DOTAP溶液の境界が見えます。
必要に応じて、マイクロキャピラリーピペットを定期的に充填して、ガラスマイクロキャピラリーピペットの圧力を再較正できるようにしてください。まず、0.1X MMRで満たされた10ミリリットルのペトリ皿で、10段階20〜24個のゼノプス胚を細かい鉗子で手動で脱ビテリン化する。ウエストのビテリンエンベロープをつかみ、胚を傷付けないようにします。
実験者の左右の両方の手に鉗子を使用して、ビテリンエンベロープの泡をポップし、ビテリンエンベロープから胚を放出します。ビテリンエンベロープを取り除くときに胚を傷つけないように注意してください。次に、カットチップ付きのプラスチックトランスファーピペットを使用して、5〜10個の脱ビテリン化ステージ22〜24胚を1X MMRで満たされた10ミリリットルのペトリ皿に移します。
ステレオ顕微鏡の下で、ペトリ皿の脱ビテリン化胚の1つを鉗子でつかみ、前極が視野に上がるように胚を配置します。次に、胚が横に横たわっていて、左から右の目の芽の1つが上向きになるように向けます。実験者の非支配的な手に鉗子を持ち、実験者の支配的な手で胚を保持し、表皮のすぐ下の腹側または側側からガラスマイクロピペットの先端を眼芽に導入する。
70~210ナノリットルのDNA/DOTAP溶液を注入します。その後、胚を回し、胚の反対側の他の目の芽に同じマイクロ注射を行います。各実験で6〜10個の胚の両方の目の芽を注入する。
マイクロインジェクション後、1X MMRを備えたペトリ皿に約30分間胚を保存し、創傷治癒を容易にします。30分後、注入した胚をプラスチック転写ピペットで0.001%漂白剤フェニルチオカルバミドで0.1X MMR溶液に移し、色素沈着を軽減する。ペトリ皿を蓋で覆い、胚がステージ46から47でオタマジャクシに発展するまで約5日間胚を培養します。
このプロトコルは、1〜10の視軸索アーバーでGFPを発現する注入されたゼノプス胚の30〜60%の成功率をもたらす。GFPの代表的な共焦点画像は、無傷のゼノプスオタマジャクシにおける発現制御および変異型視軸索アーバーを示す。APC、APCNTERM、およびAPBβ猫の2つのドメイン変異体をpCS2プラスミドにクローン化した。
GFP制御およびAPC変異型視軸索アーバーのZシリーズ画像を再構成した。枝数、総アーバー枝長、平均枝長さのプロットは、軸軸のアーバーを発現する制御とAPC変異体との間の観察された違いを確認する。回帰線を使用した枝数と平均分岐長の追加散布図は、これらのパラメータとAPCドメインを表現する視軸索アーバーとの間の逆相関を示します。
マイクロ毛細管ピペットの先端は、眼芽の上にある灰色の表皮が各マイクロ注射の間に膨らむように、眼芽に正しく表面的に挿入されなければならない。この手順は、これらの光学ニューロンからの軸索の成長、標的化、分岐を評価しながら、光学ニューロンの特定の遺伝的機能を標識および変更するために使用することができる。このDNAマイクロ注入およびリポフェクション技術により、発生神経生物学の研究者は、無傷で生きているゼノプス・ラエビス・オタマジャクシで光学軸索を調節する細胞自律分子メカニズムを研究することができました。
