이 비디오에서는 시신경에서 외인성 DNA 구조를 표현하는 방법과 GFP를 표현하는 광학 축산 아보르를 그대로, 살아있는 제노푸스 라예비스 올챙이를 이미지하는 방법을 보여줍니다. 이것은 살아있는 척추동물 모형 시스템에서 발전하는 개별 적인 광학 축산 식에서 세포 자율 유전자 기능의 측정을 허용하는 일시적인 세포 특정 전염을 위한 저렴하고 간단한 절차입니다. 절차를 시연하는 것은 나 자신, 소피아 다오, 연구 조수, 박사 타미라 엘룰, 실험실 수석 연구원이 될 것입니다.
시작하려면 당겨져 있는 유리 마이크로 모세관 파이펫 의 끝을 미세한 집게로 부드럽게 잘라냅니다. 마이크로필을 사용하여 미네랄 오일로 유리 마이크로 모세관 파이펫을 백필하여 마이크로 파이펫의 잘린 끝에 작은 미네랄 오일 방울이 나타납니다. 유리 마이크로 모세관 파이펫을 미네랄 오일로 반쯤 채웁니다.
인젝터에서 플런저를 반쪽으로 배출하고 당겨진 유리 마이크로 모세관 파이펫을 주입 홀더에 적재합니다. 그런 다음 플런저를 전체 범위로 확장하여 마이크로 모세관 파이펫이 인젝터에 강하게 부착되어 플런저의 연장과 함께 움직이지 않는지 확인합니다. DNA/DOTAP 혼합물의 마이크로리터 드롭 3개를 파라핀 용지의 1인치 정사각형 시트에 전달합니다.
스테레오 해부 현미경에서 유리 마이크로 모세관 파이펫의 끝을 DNA /DOTAP 드롭으로 이동합니다. 주사 장치에 충진 옵션을 사용하여 DNA/DOTAP 드롭을 유리 마이크로 모세관 파이펫에 천천히 빨아 넣습니다. 미네랄 오일과 DNA/DOTAP 용액 사이의 경계는 DNA/DOTAP 용액의 약간의 불투명도로 인해 유리 마이크로 모세관 파이펫에서 볼 수 있습니다.
필요한 경우, 유리 마이크로 모세관 파이펫의 압력이 재보정할 수 있도록 주기적으로 마이크로 모세관 파이펫을 채우는 것을 중단하십시오. 첫째, 0.1X MMR로 채워진 10 밀리리터 페트리 접시에서 10단계 20~24개의 제노푸스 배아를 미세한 집게로 수동으로 비활성화합니다. 배아를 손상시키지 않도록 허리에 비텔린 봉투를 잡습니다.
실험자의 좌우 양쪽에 집게를 사용하면 비텔린 봉투의 거품을 터뜨리고 진동 봉투에서 배아를 방출합니다. 비텔린 봉투를 제거할 때 배아를 다치게 하지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 절단 팁이 있는 플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 5~10개의 진동단계 22~24개의 배아를 1X MMR로 채워진 10밀리리터 페트리 접시로 옮길 수 있습니다.
스테레오 현미경의 밑에, 포셉을 가진 페트리 접시에 있는 탈 유리화한 배아 의 한개를 붙잡고 그것의 전방 극이 시야에서 뾰족할 수 있도록 배아를 배열합니다. 그런 다음 배아를 우회적으로 거짓말을하고 왼쪽에서 오른쪽 눈 싹 중 하나가 위쪽으로 향하고 있도록 배아를 지향합니다. 실험자의 지배적인 손에 집게로 배아를 잡고 실험자의 지배적 인 손으로, 눈 싹에 표피 바로 아래 복부 또는 등쪽 에서 유리 마이크로 파이펫의 끝을 소개합니다.
DNA/DOTAP 용액의 70~210나노리터를 주입한다. 그런 다음 배아를 돌리고 동일한 마이크로 주입을 배아의 모순된 쪽에 있는 다른 눈싹으로 수행합니다. 각 실험에서 6~10개의 배아의 눈싹을 모두 주입합니다.
마이크로 주입 후, 상처 치유를 용이하게하기 위해 약 30 분 동안 1X MMR과 페트리 접시에 배아를 저장합니다. 30분 후, 주입된 배아를 플라스틱 이송 파이펫으로 0.1X MMR 용액으로 0.001%의 표백제 페닐티오카르바미드를 사용하여 색소 침착을 감소시게 한다. 태아가 46~47단계에서 올챙이로 발전할 때까지 약 5일 동안 배아를 배양하기 위해 뚜껑을 뚜껑으로 덮고 있습니다.
이 프로토콜은 1-10 개의 광학 축산 식에서 GFP를 표현하는 주입 된 제노푸스 배아의 성공률을 30~ 60 %의 성공률을 산출합니다. GFP의 대표적인 공초점 이미지는 그대로 제노푸스 올챙이에서 표현 제어 및 돌연변이 광학 축산 식을 보여줍니다. APC, APCNTERM 및 APBbeta 고양이의 두 개의 도메인 돌연변이가 pCS2 플라스미드로 복제되었습니다.
GFP 제어 및 APC 돌연변이 광학 축산식 소목의 Z 시리즈 이미지가 재구성되었습니다. 분기 수, 총 식목 분기 길이 및 평균 분기 길이의 플롯은 축축아를 표현하는 제어와 APC 돌연변이 사이의 관찰된 차이를 확인합니다. 회귀 선이 있는 평균 분기 길이에 비해 분기 수의 추가 분산 플롯은 APC 도메인을 표현하는 이러한 매개 변수와 광학 축산 식소 사이의 역 상관 관계를 보여 준다.
마이크로 모세관 파이펫의 끝은 각 마이크로 주입 중에 눈싹을 덮치는 회색 표피가 팽창되도록 눈 싹에 매우 피상적으로 삽입해야합니다. 이 절차는 이러한 광학 뉴런에서 축축물의 성장, 타겟팅 및 분기를 평가하는 동안 시신경의 특정 유전 기능을 라벨과 변경하는 데 사용할 수 있습니다. 이 DNA 미세 주입 및 지방 흡입 기술은 발달 신경생물학에 있는 연구원이 그대로, 살아있는 제노푸스 laevis 올챙이에 있는 광학 축소 절기를 통제하는 세포 자율 분자 기계장치를 연구하는 것을 허용했습니다.
