בסרטון זה, אנו מדגימים כיצד לבטא מבני דנ"א אקסוגניים בנוירונים אופטיים וכיצד לדמיין ארברים אקסונאליים אופטיים מבטאים GFP בודדים בערימות קסנופוס לאבס שלמות וחיות. זהו הליך זול ופשוט עבור transgenesis תאים ארעיים ספציפיים המאפשר קביעת תפקוד גנים אוטונומיים התא arbors אקסונאלי אופטי בודדים, פיתוח במערכת מודל בעלי חוליות חיים. בהדגמת ההליך יהיו אני, סופיה דאו, עוזרת מחקר, וד"ר טמירה אלול, חוקרת מעבדה.
כדי להתחיל, בעדינות קליפ קצה של פיפטה מיקרו נימי זכוכית משך עם מדפים עדין. למלא את פיפטה מיקרו נימי זכוכית עם שמן מינרלי באמצעות MICROFIL כך טיפה זעירה של שמן מינרלי מופיע בקצה קצוץ של פיפטה מיקרו. מלאו את פיגט המיקרו נימי הזכוכית באמצע הדרך בשמן מינרלי.
במזרק, להוציא את הבוכנה באמצע הדרך ולטעון את פיפטה מיקרו נימי זכוכית משך לתוך מחזיק ההזרקה. לאחר מכן להאריך את הבוכנה במידה המלאה כדי לאשר כי פיפטה נימי מיקרו מחובר בחוזקה מזרק ולא זז עם הרחבת הבוכנה. מעבירים טיפת מיקרוליטר של תערובת הדנ"א/DOTAP לגיליון ריבועי של נייר פרפין.
תחת מיקרוסקופ ניתוח סטריאו, הזז את קצה פיפטה נימי מיקרו זכוכית לתוך טיפת DNA / DOTAP. השתמש באפשרות המילוי על מנגנון ההזרקה, למצוץ לאט את ה-DNA / DOTAP טיפה לתוך פיפטה נימי מיקרו זכוכית. הגבול בין השמן המינרלי לבין פתרון הדנ"א/DOTAP נראה בפיפיט המיקרו נימי הזכוכית בשל האטימות הקלה של תותב הדנ"א/DOTAP.
במידת הצורך, להפסיק למלא את פיפטה נימי מיקרו מעת לעת כדי לאפשר את הלחץ פיפטה נימי מיקרו זכוכית לכייל מחדש. ראשית, בצלחת פטרי 10 מיליליטר מלא 0.1X MMR, ידנית de-vitellinize 10 שלב 20 כדי 24 עוברי קסנופוס עם ממטרים בסדר. אחוז במעטפת הויטליין במותניים כדי להימנע מפגיעה בעוברים.
עם מטליות ביד שמאל ובימין של הניסוי, פופ הבועה של מעטפת vitelline ולשחרר את העובר מן המעטפה vitelline. יש לדאוג לא לפגוע בעוברים בעת הסרת מעטפת הויטלין. לאחר מכן השתמש פיפטה העברת פלסטיק עם קצה לחתוך להעביר חמישה עד 10 de-vitellinized שלב 22 כדי 24 עוברים לצלחת פטרי 10 מיליליטר מלא 1X MMR.
תחת מיקרוסקופ סטריאו, לתפוס את אחד העוברים de-vitellinized בצלחת פטרי עם מטליות ולסדר את העובר, כך מוט anterior שלה הוא הצביע בשדה המבט. לאחר מכן לכוון את העובר כך שהוא שוכב באופן מאוחר ואחד ניצני העין משמאל לימין פונה כלפי מעלה. החזק את העובר עם המעצורים ביד הלא דומיננטית של הניסוי ועם היד הדומיננטית של הניסוי, להציג את קצה פיפטה מיקרו זכוכית מהצד הגחוני או הגבי ממש מתחת לאפידרמיס לתוך ניצן העין.
להזריק בין 70 ל 210 nanoliters של פתרון DNA / DOTAP. ואז להפוך את העובר סביב ולבצע את אותה הזרקת מיקרו לתוך ניצן העין השני בצד ההפוך של העובר. להזריק את שני ניצני העין של שישה עד 10 עוברים בכל ניסוי.
לאחר הזרקת מיקרו, לאחסן עוברים בצלחת פטרי עם 1X MMR במשך כ 30 דקות כדי להקל על ריפוי הפצע. לאחר 30 דקות, להעביר את העוברים מוזרק עם פיפטה העברת פלסטיק לתוך פתרון MMR 0.1X עם 0.001% הלבנת סוכן phenylthiocarbamide כדי להפחית פיגמנטציה. מכסים את צלחת פטרי עם מכסה לתרבות העוברים במשך כחמישה ימים עד העוברים התפתחו ראשנים בשלבים 46 עד 47.
פרוטוקול זה מניב שיעור הצלחה של 30 עד 60% של עוברי קסנופוס מוזרקים המבטאים GFP באחד עד 10 ארבורים אקסונאליים אופטיים. תמונות קונפוקליות מייצגות של GFP מראות את השליטה המביעים ואת ארברים אקסונאליים אופטיים מוטנטים בחלקי ראשן קסנופוס שלמים. שני מוטציות דומיין של APC, APCNTERM ו- APBbeta-cat משובטים לפלסמידים pCS2.
תמונות מסדרת Z של בקרת GFP ו- APC מוטנטים אופטיים axonal arbors שוחזרו. חלקות של מספר ענפים, אורך ענף ארבור כולל, ואורך ענף ממוצע מאשרים הבדלים שנצפו בין שליטה לבין מוטנט APC המבטא ארברים אקסונאליים. חלקות פיזור נוספות של מספר ענפים לעומת אורך ענף ממוצע עם קווי רגרסיה מראות מתאם הפוך בין פרמטרים אלה לבין arbors אקסונאלי אופטי המבטאים תחומי APC.
הקצה של פיפטה נימי מיקרו חייב להיות מוכנס כראוי באופן שטחי מאוד לתוך ניצן העין, כך האפידרמיס האפור overlying ניצן העין מתנפח במהלך כל הזרקת מיקרו. הליך זה יכול לשמש הן תווית ולשנות תפקוד גנטי ספציפי נוירונים אופטיים תוך הערכת גידול, מיקוד, הסתעפות של אקסונים מתאי עצב אופטיים אלה. הזרקת מיקרו DNA זו וטכניקת ליפוקציה אפשרה לחוקרים בנוירוביולוגיה התפתחותית לחקור מנגנונים מולקולריים אוטונומיים של תאים המווסתים את ארבוריזציה של אקסון אופטי בערימות קסנופוס לאביס שלמות וחיות.
