Nous avons mis au point une méthode rigoureuse pour isoler les cellules du lait maternel humain afin d’étudier la phagocytose cellulaire dépendante des anticorps, ou ADCP, par phagocytes de lait maternel contre les cibles du VIH. Cette technique facilite l’isolement relativement rapide et facile des cellules du lait maternel afin d’évaluer la capacité des populations de leucocytes à effectuer l’ADCP. Alisa Fox, technicienne de mon laboratoire, démontrera la procédure.
Après avoir sélectionné un antigène cible pertinent, utilisez un kit commercial pour biotinylate la protéine d’intérêt selon le protocole du fabricant. Et déposez l’échantillon biotinylé dans la chambre haute d’une colonne de spin. Ajouter pbs jusqu’à 400 microlitres et capuchon de la chambre avant d’insérer la colonne dans un tube de collecte pour centrifugation.
Après avoir jeté le flux à travers, ajouter PBS à 400 microlitres pour une deuxième centrifugation. Jetez le flux à travers, ajouter PBS à 400 microlitres, et mesurer la concentration de protéines par un spectrophotomètre pour conjuguer la protéine biotinylated aux microsphériques micromètres. Incuber six microgrammes de protéines avec 12 microlitres de perles de stock dans 200 microlitres de PBS par plaque de perles conjuguées à température ambiante pendant deux heures, avec vortex doux toutes les 20 minutes.
À la fin de l’incubation, granuler les perles conjuguées par centrifugation et jeter le supernatant. Après un léger vortex, resuspendez la protéine en 1200 microlitres de 0,1%BSA dans PBS, et lavez le tube par centrifugation deux fois de plus comme cela vient de le démontrer. Après le dernier lavage, resuspendez la pastille en 1200 microlitres dans PBS plus BSA.
Pour mettre en place des plaques d’analyse ADCP, préparez d’abord 12 dilutions microlitres d’anticorps, ou le sérum immunitaire d’intérêt, dans 2%BSA dans PBS dans une plaque ronde de puits de 96 bas. Ajouter 10 microlitres de perles conjuguées par puits à l’assiette pendant une incubation de deux heures à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, ajouter 200 microlitres de PBS plus BSA.
Après avoir obtenu du lait maternel humain auprès de femmes allaitantes en bonne santé exprimant à l’aide d’une pompe, dans les quatre heures suivant l’expression séparer le contenu du lait par centrifugation et verser soigneusement le lait écrémé et la graisse, laissant la pastille cellulaire intacte. Essuyer l’intérieur du tube avec un lingette sans peluche pour enlever toute la graisse de la paroi du tube et ajouter 10 millilitres de PBS plus HSA. Resuspendez la pastille avec un tuyautage doux pour éviter l’activation cellulaire dans l’apoptose, et transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres pour centrifugation.
Après un deuxième lavage dans PBS plus HSA comme juste démontré, résuspendez doucement les cellules dans un à deux millilitres de PBS frais plus HSA pour compter. Pour un essai ADCP, inversez rapidement la plaque ADCP préparée pour décanter le supernatant après la centrifugation finale et ajoutez cinq fois 10 à une quatrième cellule de lait maternel fraîchement isolée dans 200 microlitres de PBS plus BSA pour une incubation de deux heures à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, centrifuger les cellules et laver les granulés deux fois dans 200 microlitres de PBS frais comme démontré.
Après le dernier lavage, tacher les cellules avec 0,5 microgramme par millilitre de tache fixable de viabilité 450 par puits dans 50 microlitres de PBS pendant 30 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, pelleter les cellules pendant deux lavages dans pbs frais comme démontré, et tacher les cellules pour les marqueurs leucocytes d’intérêt pendant 30 minutes à température ambiante, protégé de la lumière. À la fin de l’incubation, recueillir la centrifugation des cellules, et laver les cellules deux fois dans 200 microlitres de 1%BSA plus PBS par lavage.
Après le dernier lavage, fixer les granulés dans 200 microlitres de 0,5% de formaldéhyde par puits pendant 30 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière. Pour l’analyse cytométrique de flux des échantillons de cellules, réglez un cytomètre d’écoulement équipé d’un lecteur de plaque à haut débit pour retirer 175 microlitres d’échantillon et recueillir 5000 cellules par puits. Effectuez le gating initial pour éliminer les doublets et les débris sur une parcelle de dispersion vers l’avant par rapport à la parcelle de dispersion latérale.
Utilisez une parcelle de tache de dispersion latérale par rapport à la viabilité pour éliminer les cellules mortes. Et utilisez une parcelle latérale scatter versus CD45 pour différencier les principales classes de leucocytes. Pour toutes les cellules positives CD45, ou pour chaque sous-ensemble de leucocytes d’intérêt, mesurez l’activité de phagocytose cellulaire dépendante de l’anticorps en çant avec un marqueur sur les cellules positives de perle dans un histogramme du canal fluorophore approprié pour les perles conjuguées.
Calculez ensuite les scores de phagocytose cellulaire dépendante de l’anticorps comme médiane de l’intensité de fluorescence des cellules positives de perle par le pourcentage du CD45 total plus les cellules dans la population positive. Ici, la stratégie de gating pour éliminer des doublets, des débris, et des cellules mortes est montrée. Entre un et 12 % du total des cellules vivantes sont généralement des leucocytes positifs CD45, la plupart des prétendus ltéraux se dispersant faiblement à intermédiaire CD45 faibles monocytes semblant être des précurseurs, ou à des cellules immatures, basées sur la dispersion latérale par rapport au Gating CD45.
Les prétendus granulocytes sont définis comme des cellules intermédiaires CD45 de dispersion latérale élevée. La mesure de l’activité ADCP des cellules du lait maternel fraîchement isolées à l’aide d’un anticorps monoclonal humain spécifique au VIH à un mois après le départ révèle que le traitement par inhibiteur de l’actine Cytochalasine D et ou récepteur Fc bloquant les anticorps avant l’incubation avec des perles couplées liées à l’anticorps entraîne une activité ADCP à ou en dessous de celle observée en présence d’anticorps témoins. Le score ADCP déterminé pour le total des cellules positives CD45 est généralement entre 25 et 35 fois au-dessus des niveaux de fond, défini à l’aide d’un contrôle négatif, anticorps monoclonal anti-anthrax.
Chaque échantillon de lait maternel est unique et certaines granulés peuvent être difficiles à voir. En outre, les populations de leucocytes, et donc les scores ADCP, peuvent varier énormément d’un échantillon à l’autre.
