Le VIH est incurable en raison de sa persistance dans les réservoirs cellulaires et anatomiques. Cette méthode permet une évaluation du réservoir vih des cellules immunitaires isolées des poumons. Cette technique permet l’isolement des cellules T muqueuses pulmonaires et des macrophages alvéolaires du liquide BAL pour une évaluation phénotypique ou virologique plus poussée en tant que réservoirs cellulaires du VIH.
La compréhension de la biologie des macrophages alvéolaires et des lymphocytes T CD4 positifs et leur contribution au réservoir vih pourraient donner un aperçu important des défis auxquels est confrontée une guérison du VIH. L’isolement des macrophages primaires du BAL peut être appliqué à divers autres domaines de recherche, y compris les maladies pulmonaires inflammatoires ou infectieuses telles que l’asthme et la tuberculose. Après avoir obtenu le liquide BAL d’un patient humain selon les protocoles standard, vortex le fluide dans le tube de collecte d’origine avant de transférer l’échantillon à un tube de 50 millilitres dans une armoire de biosécurité.
Si le liquide semble très trouble ou contaminé par des tissus filamenteux, filtrez l’échantillon à travers un filtre à mailles en nylon de 70 micromètres dans un nouveau tube de 50 millilitres. Après centrifugation, transférer le supernatant dans un nouveau tube de 50 millilitres et utiliser une pointe de pipette pour briser délicatement la pastille contenant toutes les cellules BAL. Resuspendez la pastille en un millilitre de RPMI 1640 moyen et ajoutez un millilitre du supernatant réservé de chacun des 10 tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.
Ajouter des aliquots de 10 millilitres du supernatant restant dans des tubes coniques de 15 millilitres et placer tous les échantillons de supernatants dans le stockage de moins 80 degrés Celsius. Diluer la suspension des cellules à granulés en 10 millilitres de milieu pour chaque tranche de 25 millilitres d’échantillon d’origine et recueillir les cellules BAL par centrifugation. Puis resuspendez la pastille en un millilitre de milieu complété par 10% sérum bovin fœtal, ou FBS, pour le comptage.
Pour le tri de cellules mononucléaires entières de BAL et périphériques de sang, ajoutez cinq fois 10 aux cinq cellules à chacun des deux tubes de polystyrène rond de cinq millilitres par sous-ensemble pour les contrôles de compensation non tachés et vitrés de viabilité et ajoutez le reste de chaque échantillon de sous-ensemble dans un tube de cinq millilitres par échantillon. Recueillir les cellules par centrifugation et réutiliser les granulés de contrôle dans 100 microlitres de PBS par tube sur la glace jusqu’à ce qu’ils soient utilisés. Resuspendez les granulés des cellules pour trier en 250 microlitres d’une dilution sur 20 du tampon de blocage des récepteurs Fc pendant une heure à quatre degrés Celsius pour bloquer toute liaison non spécifique.
À la fin de l’incubation de blocage, ajouter le cocktail d’anticorps approprié d’intérêt pour une incubation supplémentaire d’une heure à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation primaire d’anticorps, ajouter un millilitre de PBS à chaque tube pour la centrifugation et réutiliser les granulés dans 250 microlitres de tampon de tri sur la glace protégé de la lumière jusqu’au tri. Pour préparer les contrôles de compensation, ajoutez trois gouttes chacune des perles de compensation d’immunoglobuline anti-souris et les perles négatives de compensation de contrôle par millilitre de PBS à un tube de microcentrifugeuse et transférez 100 microlitres de la solution de perle à chaque échantillon pour être employé pour la compensation.
Ajouter un microlitre de chaque anticorps dans le cocktail à chaque tube séparé contenant des perles et ajouter un microlitre de tache de viabilité à chaque tube de contrôle de la compensation des taches de viabilité. Après 20 minutes à quatre degrés Celsius protégés de la lumière, lavez les échantillons avec un millilitre de PBS par tube et réutilisez les granulés dans 250 microlitres de PBS frais par tube. Chargez l’échantillon de commande non taché de la cellule BAL entière sur le cytomètre d’écoulement et installez la matrice de compensation.
Chargez ensuite le tube d’échantillon et triez les cellules sous basse pression, en ténuant pour exclure le bruit, pour inclure les cellules vivantes et cd45-positives, et pour exclure les doublets. Au sein de la population myéloïde plus grande, trier les cellules CD206 et CD169 à double positif sous forme de macrophages alvéolaires. Au sein de la plus petite population de lymphocytes, isoler les cellules CD3 positives et trier les populations cd4 et CD8 mono-positives.
Pour trier l’échantillon périphérique de cellules mononucléaires sanguines, portez pour exclure le bruit et les doublets et pour inclure les cellules CD45-positives vivantes comme démontré. Après avoir tété sur CD3, portez les cellules CD3-négatives, CD14-positives pour trier les monocytes mono-positifs et portez les cellules CD3-positives, CD4, et CD8-positives pour trier les deux populations mono-positives. Lorsque l’on compte l’échantillon bal entier, différents types de cellules peuvent être visualisés, y compris les macrophages ronds plus grands et les lymphocytes ronds plus petits.
Les macrophages sont le type de cellule le plus abondant dans le liquide BAL, représentant environ 85% des cellules dans les poumons non-fumeurs. Ces cellules sont enrichies chez les fumeurs au point de sembler presque exclusives et ont tendance à être agrandies d’environ 40% par rapport aux macrophages observés chez les non-fumeurs. Les marqueurs utilisés pour trier les macrophages alvéolaires à partir d’échantillons de liquide BAL ont été choisis sur la base de phénotypes précédemment décrits de macrophages alvéolaires, tels que le récepteur mannose CD206 qui est présent sur les cellules phagocytiques et le récepteur de la sialoadhesine CD169.
Après leur isolement, les macrophages alvéolaires et d’autres types de cellules peuvent être utilisés pour l’immunophéotypage par cytométrie d’écoulement, analyses fonctionnelles immunologiques, ou quantification de réservoir par PCR ultrasensible. Cette technique permet l’accès à des macrophages très purs résidant dans les tissus, qui ont toujours été difficiles à atteindre, permettant l’examen auparavant inaccessible de la population importante de cellules immunitaires.
