Ce protocole décrit certaines méthodes pour quantifier la formation de gouttelettes lipidiques chez les organoïdes intestinaux humains. Il peut être utilisé comme une plate-forme de dépistage à haut débit pour tester les médicaments qui modulent la formation de gouttelettes lipidiques. La méthode que nous décrivons est basée sur un colorant spécifique aux gouttelettes lipidiques et des organoïdes intestinaux dérivés de biopsie.
Il fournit ainsi un modèle stable, précis et physiologiquement pertinent pour la formation de gouttelettes lipidiques. Ce protocole peut être utilisé pour dépister les nouveaux candidats médicaments spécifiques au patient qui modulent la formation de gouttelettes lipidiques, par exemple, chez les patients déficients en DGAT1. Cet essai de formation de gouttelette de lipide peut également être appliqué à d’autres types de cultures organoïdes pour étudier le métabolisme de lipide dans d’autres types de cellules.
L’analyse dépend dans une large mesure de la densité de la culture organoïde. Essayez d’assurer une densité organoïde constante entre les échantillons et les expériences. La démonstration visuelle de cet essai est critique parce qu’il est important de montrer comment l’organoïde devrait être cultivé et comment ils devraient être manipulés pour assurer l’analyse appropriée de la formation de gouttelettes lipidiques.
Après avoir préparé les organoïdes, aspirez soigneusement le milieu de culture sans déranger les gouttelettes de la matrice membranaire du sous-sol. Ajouter 500 microlitres de milieu basal froid au premier puits d’organoïdes. À l’aide d’une pipette P1000, pipette doucement de haut en bas pour perturber les gouttelettes matricielles membranaires du sous-sol avec des organoïdes.
Répétez cette procédure avec le même milieu dans le prochain puits que nécessaire, mais ne récoltez pas plus de deux puits par 500 microlitres de milieu basal. Recueillir les organoïdes dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre à faible liaison, et les faire tourner dans une mini-centrifugeuse de table pendant 15 à 20 secondes. Ajouter 400 microlitres de trypsine aux organoïdes filés vers le bas.
Incuber dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, utilisez une pipette P200 pour pipette doucement la suspension de haut en bas pour perturber les agrégats restants des cellules. Incuber dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.
Lorsqu’il ne reste plus qu’une seule cellule, ajouter un millilitre de milieu basal et faire tourner les cellules dans une mini-centrifugeuse de table pendant 15 à 20 secondes. Aspirez complètement le surnatant. Utilisez une pipette P200 pour suspendre à nouveau les cellules individuelles dans 200 microlitres de hSI-EM frais, et ajouter 800 microlitres supplémentaires de hSI-EM.
Comptez ensuite le nombre de cellules en suspension et calculez le volume de cellules nécessaires à la densité cellulaire finale. Sortez le volume approprié de suspension et ajustez la densité à 750 cellules par microlitre. Ajouter la matrice membranaire du sous-sol à la suspension cellulaire dans un rapport de deux pour un.
Pipette doucement la suspension pour mélanger en prenant soin d’éviter de créer des bulles. Dans une assiette de culture préchauffée, épépinez trois gouttelettes de 10 microlitres par puits si la plaque a 24 puits ou une gouttelette de cinq microlitres par puits si la plaque a 96 puits. Placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant 10 à 15 minutes pour solidifier les gouttelettes.
Pendant ce temps, préchauffer un volume approprié de hSI-EM+Y dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius. Après cela, ajouter soigneusement le hSI-EM+Y préchauffé à chaque puits de la plaque. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de dioxyde de carbone.
Après deux à trois jours, remplacez le milieu par hSI-EM et assurez-vous de le rafraîchir deux à trois fois par semaine. Tout d’abord, peser 0,2 grammes d’acide oléique liquide à température ambiante. Ajouter 1,5 millilitres de PBS stérile de qualité culturelle et chauffer le mélange à 70 degrés Celsius pendant une heure en s’assurant de vortex par intermittence.
Ensuite, pesez 5,89 grammes de BSA sans acides gras et dissolvez-le en 33,9 millilitres de PBS. Réchauffer le mélange dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que le BSA soit complètement dissous. Vortex le mélange d’acide oléique à nouveau pour créer une émulsion de gouttelettes fines et immédiatement l’ajouter à la solution BSA à l’aide d’une pipette en verre.
Gardez le mélange à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes jusqu’à ce qu’une solution jaunâtre claire reste. Passer les organoïdes comme décrit précédemment et semer les cellules individuelles dérivées d’organoïdes dans une plaque noire à fond clair de 96 puits. Le sixième jour de la culture sur hSI-EM, remplacer le milieu de culture par hSI-EM contenant un millimolaire de l’acide oléique et conjugué BSA.
Incuber les cellules pendant 16 à 17 heures à 37 degrés Celsius en présence ou en l’absence d’inhibiteur du DGAT1 de 0,1 micromolaire. Après cela, aspirer le milieu sans déranger les gouttelettes de matrice membranaire du sous-sol. Fixez les organoïdes en ajoutant 100 microlitres de formaldéhyde tamponné neutre à quatre pour cent aux puits pendant 30 minutes à température ambiante.
Retirer délicatement le formaldéhyde et laver soigneusement les cellules avec 150 microlitres de PBS par puits. Tacher les cellules pour les gouttelettes lipidiques avec 025 milligrammes par millilitre LD540 et DAPI dans PBS pendant 15 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Ensuite, lavez soigneusement les puits avec PBS.
Pour une vue d’ensemble, les images d’organoïdes entiers utilisent un subjectif 40X adapté à l’imagerie fluorescente confocale. Réglez le microscope à l’image pour DAPI et le colorant LD540 en utilisant les paramètres d’excitation et d’émission montrés ici. Réglez la taille du sténopé sur une unité aérosée pour une résolution z-axe suffisante.
Pour l’image de la moitié d’un organoïde sphérique définir une z-pile à environ 85 micromètres. À l’aide d’un système de traitement d’image approprié, transformez la pile z de chaque organoïde en une projection maximale en cliquant sur Image, Stacks, Z Project. Fixez le seuil de la projection maximale à un niveau dans lequel il n’y a pas de signal LD540 visible dans l’échantillon de contrôle du véhicule BSA en cliquant sur Image, Ajuster, Seuil.
Utilisez ces paramètres pour seuilr chaque image. Ensuite, mesurez la zone totale de fluorescence pour chaque projection maximale à l’aide de la fonction Analyser, Analyser les particules. Pour une analyse appropriée de la formation de gouttelettes lipidiques, les organoïdes ne doivent pas être ensemencés trop densément avant la stimulation par l’acide oléique et la coloration subséquente.
Ceci est particulièrement important pour la lecture confoccale et plaque-lecteur puisque le chevauchement des organoïdes pourrait interférer avec la fluorescence. Après stimulation avec un millimolaire d’acide oléique pendant la nuit, la formation de gouttelettes lipidiques peut être visualisée avec un microscope inversé à champ lumineux. L’accumulation de gouttelettes lipidiques disperse la lumière transmise, et donc les organoïdes semblent plus foncés, tandis que les organoïdes non stimulés ont un aspect translucide.
Une fois que les organoïdes stimulés par l’acide oléique sont fixes et tachés, la formation de gouttelettes lipidiques peut être visualisée à l’aide d’un microscope confocal. Comme les organoïdes sont des structures 3D, un microscope épifluorescent régulier n’est pas approprié en raison du signal de fond hors de discussion, de sorte qu’une pile de z confocal est utilisée pour caractériser le LDF chez les organoïdes. La quantification des échantillons de microscopie confoccale peut également être effectuée à l’aide d’un lecteur de plaque fluorescente normalisé au signal fluorescent hoechst.
L’analyse de lecteur de plaque indique une diminution significative du signal de LD540 dans les cellules organoïdes traitées avec l’inhibiteur de DGAT1 comparé aux organoïdes non traités. La quantification de la formation de LD dans les cellules individuelles peut être réalisée à l’aide d’un cytomètre d’écoulement. La stratégie de gating montrée ici est pour les organoïdes intestinaux humains dissociés.
Les histogrammes représentatifs pour le SSC-A et le signal LD540 de la population finale de cellules vivantes montrent que la formation de gouttelettes lipidiques entraînera une augmentation du SSC-A en raison de la formation de gouttelettes lipidiques intracellulaires. En outre, les taches LD540 pour les lipides qui sont stockés dans les gouttelettes lipidiques, et le signal augmentera également à l’induction de la formation de gouttelettes lipidiques. En tant que tel, la formation de gouttelettes lipidiques est mesurée comme un changement dans l’intensité fluorescente moyenne de SSC-A et LD540.
Les étapes les plus cruciales de ce protocole sont la culture des organoïdes intestinaux humains et la corrugation appropriée de l’acide oléique au BSA. Pour répondre à plus de conditions, cet essai peut être analysé à l’aide d’un lecteur de plaque fluorescente. Pour corriger le nombre organoïde par puits, le signal LD540 a été normalisé au signal DAPI.
Avec cette technique, les chercheurs peuvent étudier la formation de gouttelettes lipidiques dans les systèmes organoïdes, et améliorer diverses techniques d’analyse telles que la microscopie électronique pour valider leurs résultats.
