Les systèmes microphysiologiques ont la capacité d’imiter la réponse pharmacocinétique et toxicologique du corps humain à des traitements spécifiques d’intérêts. Les systèmes microphysiologiques ont le potentiel de remplacer les tests sur les animaux, car leur utilisation peut améliorer la puissance prédictive des méthodes in vitro et réduire le coût et le temps des études pharmacocinétiques et toxicologiques. 24 heures avant l’administration de la substance d’essai, diviser un aliquot de 800 microlitres de William ES moyen entre les compartiments plus grands et plus petits des deux puces d’organe, et aspirer le milieu basolateral et apical de chaque équivalent de barrière intestinale dans les 24 plaques de puits préparées.
À l’aide de forceps stériles, intégrer un insert par deux circuits de copeaux d’organe dans le compartiment plus grand et ajouter 200 microlitres de DMEMS sur le côté apical. À l’aide de larges pointes d’alésage, intégrer 20 équivalents hépatiques par circuit dans le compartiment plus petit des deux copeaux d’organe et connecter le système à l’unité de contrôle. Connectez ensuite l’unité de commande à un approvisionnement en air pressurisé et réglez la pression à environ plus ou moins 300 barres et à une fréquence de pompage de 0,3 Hertz.
Le lendemain diluer la solution d’acétaminophène stock à une concentration de 12 micromolaires. Pour remplacer le milieu du système, aspirez le milieu basolateral et apical de l’équivalent de la barrière intestinale dans les deux copeaux d’organe et ajoutez 500 microlitres de milieu de culture approprié frais dans le grand compartiment du côté basolateral organoïde et 300 microlitres au petit compartiment. Après vérification des bulles, émuler l’administration orale avec l’ajout de 200 microlitres d’une solution d’acétaminophène de 12 micromolaires sur le côté apical de la culture intestinale insère et connecter le système microphysiologique à l’unité de contrôle.
Recueillir le volume total des côtés apical et basolateral intestinal, ainsi que du petit compartiment en triplicate aux points de temps indiqués. Lorsque tous les échantillons ont été prélevés, définissez tous les paramètres pertinents pour l’analyse HPLC tels qu’indiqués dans le tableau et filtrez la phase mobile à travers un filtre membranaire de 0,4 micron sous vide. Filtrez ensuite les échantillons à travers un filtre à seringue PVDF de taille pore de 0,22 micron et stockez les échantillons dans un flacon avant de commencer la mesure UV HPLC.
Pour évaluer la viabilité organoïde, transférez les 20 sphéroïdes de chaque réplique aux puits individuels d’une plaque de puits 96 et transférez les inserts de culture cellulaire dans les puits individuels d’une plaque de puits de 24 puits. Lavez les équivalents tissulaires trois fois avec du DPBS frais par lavage et ajoutez 300 microlitres d’un milligramme par millilitre de solution MTT à chaque puits expérimental. Après une incubation de trois heures dans l’incubateur de culture cellulaire, remplacer la solution MTT par 200 microlitres d’isopropanol par puits pour une incubation nocturne à quatre degrés Celsius pour extraire le formazan MTT de l’intestin et des équivalents hépatiques.
Le lendemain matin, transférez 200 microlitres de chaque supernatant au puits approprié dans la plaque de puits 96 et lisez le formazan sur un lecteur de plaque à 570 nanomètres pour permettre le calcul de la capacité relative des cellules à réduire le MTT en utilisant la densité optique moyenne de chaque point de temps par rapport au contrôle négatif. Pour l’analyse cytochimique et histologique des échantillons, fixez d’abord l’intestin et les équivalents hépatiques dans le paraformaldéhyde de 4% dans 0.1 PBS molaire pendant 25 minutes à la température ambiante. À la fin de l’incubation, laver les organoïdes cinq fois dans PBS pendant 10 minutes par lavage, avant de tacher les équivalents intestinaux et hépatiques avec de la tétraméthylrhodamine isothiocyanate phalloidin Alexa Fluor 647 phalloidin pendant une heure à température ambiante.
À la fin de l’incubation, transférer les échantillons au milieu de congélation pendant quelques minutes avant de casser le gel des tissus dans de l’azote liquide. Ensuite, utilisez un cryostat pour acquérir 10 à 12 microns d’épaisseur de cryo-sections sphéroïdes du foie et monter les sections tissulaires dans le milieu de montage avec DAPI pour l’imagerie par microscopie de fluorescence confocale. Pour les taches mitochondriales et nucléaires, recouvrez complètement les échantillons d’une solution de coloration mitochondriale pendant une incubation de 15 à 45 minutes à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de dioxyde de carbone.
À la fin de l’incubation, remplacer soigneusement la solution de coloration par du paraformaldéhyde de 2 à 4 % dans le PBS pendant 15 minutes à température ambiante. Après fixation, rincer délicatement les cellules deux fois avec du PBS frais pendant cinq minutes par lavage avant d’étiqueter les échantillons avec de l’acide nucléique colorant la solution de travail pendant 10 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, laver les échantillons avec trois lavages de cinq minutes dans pbs protégé de la lumière, et utiliser la tache d’acide nucléique pour faciliter la quantification du nombre de taches mitochondriales exprimant les cellules sur un microscope fluorescent avec les ensembles de filtre appropriés.
L’intégration de la barrière intestinale humaine et d’un équivalent hépatique dans un dispositif microfluidique à deux puces d’organe permet d’évaluer les propriétés pharmacocinétiques et toxicologiques des traitements d’intérêt. Après le traitement, les échantillons de médias peuvent être analysés par HPLC. Les organoïdes peuvent être analysés pour leur expression génique, leurs valeurs de résistance électrique transéthéliale, leur expression et leur activité protéiques, ainsi que pour leurs caractéristiques morphologiques.
L’analyse de MTT peut être exécutée pour évaluer la viabilité organoïde, aussi bien que pour détecter des événements toxiques très tôt en réponse au traitement d’acétaminophène. Le flux médiatique n’affecte pas significativement l’absorption de l’acétaminophène, alors qu’il améliore considérablement la fonctionnalité équivalente au foie, ce qui indique que l’absorption intestinale humaine de l’acétaminophène et le métabolisme hépatique peuvent être imités dans ce système microphysiologique. Les systèmes microphysiologiques ont le potentiel de remplacer les modèles animaux dans le développement et la découverte de médicaments, car ils imitent mieux la physiologie humaine et peuvent être utilisés pour promouvoir le développement de médicaments à une vitesse plus élevée et à moindre coût pour le risque et la complexité.
