Nous pouvons isoler et assembler des probiotiques qui peuvent à la fois promouvoir la santé des coraux tout en atténuant l’impact de la pollution et qui peuvent contribuer à la persistance d’un récif dans le monde en mutation. L’approche d’isolement et de dépistage décrite peut être utilisée pour sélectionner des micro-organismes présentant des activités métaboliques clés telles que la dégradation des polluants ou d’autres caractéristiques bénéfiques pour les organismes marins tels que les coraux. Cette méthode peut être appliquée pour isoler les micro-organismes capables de dégrader les contaminants.
Et en outre, d’autres sources de matériaux peuvent être utilisés dans les autres échantillons environnementaux tels que les plantes, le sol, l’eau, n’importe quoi. Étudiez la littérature et essayez de vous concentrer sur les souches qui peuvent être de bons candidats à votre fin. Si possible, dirigez les méthodes d’isolement de ces souches et évitez les agents pathogènes connus.
Et si vous visez à utiliser un consortium de bactéries, il est également très important d’enquêter d’abord si les membres du consortium ont une activité antagoniste les uns contre les autres. Parce que les coraux sont de plus en plus menacés d’extinction, cette méthodologie commence à être lancée dans le monde entier et il est nécessaire de propager et de normaliser la méthode. Comme certains chercheurs en coraux n’ont aucune expérience de la microbiologie conventionnelle, c’est pourquoi ils ont souvent demandé des conseils sur la façon de procéder à une telle approche.
Pour commencer, à partir de chaque site d’échantillonnage ciblé, utilisez des bouteilles stériles avec des bouchons à vis pour recueillir 500 millilitres d’eau en triplicate. Si le traitement de l’échantillon se produit plus tard, gardez les bouteilles à quatre degrés Celsius. Utilisez une paire stérile de pinces et de forceps pour couper des fragments de corail à partir du même site d’échantillonnage des échantillons d’eau.
Rincer le fragment de corail de l’échantillon à l’aide de 20 millilitres de solution stérile de 3 % saline ou d’eau de mer artificielle pour se débarrasser des bactéries libres de l’eau de mer lâchement attachées. À l’aide de forceps, placer chaque fragment de corail dans un récipient stérile avec un bouchon à vis contenant une solution saline stérile. À l’aide de forceps et de pinces stériles, peser cinq grammes de fragments de corail dans des boîtes de Pétri stériles sur une balance de pesage.
Transférer les cinq grammes d’échantillon de corail dans un mortier stérile et le macérer à l’aide d’un pilon stérile. À l’aide d’une spatule stérile, transférer l’échantillon macéré dans un flacon de culture stérile contenant 25 millilitres de solution stérile de chlorure de sodium à 3 % et 10 à 15 perles de verre de 2,5 millimètres. Utilisez une solution saline stérile de 20 millilitres pour laver le mortier dans le tube pour récupérer la quantité maximale de macération.
Pour détacher les micro-organismes de différents compartiments coralliens, gardez les flacons sous agitation constante à 150 fois g pendant 16 heures à la température de l’eau du site d’échantillonnage. Pour sélectionner les bactéries, effectuez d’abord des dilutions périodiques jusqu’à 10 à 9 négatifs dans la solution saline stérile pour les échantillons de corail et jusqu’à 10 à 6 négatifs pour les échantillons d’eau. Pipette dilutions de haut en bas cinq fois avant de jeter la pointe.
Puis vortex chacun. Vortex les échantillons pendant cinq secondes à chaque fois avant d’effectuer la prochaine dilution en série. Pipette 100 microlitres de chaque dilution sur les plats de Petri contenant 3% de liquide chlorure de sodium lysogeny bouillon agar moyen et les plaquer.
Incuber les plaques pendant un à trois jours à la température cible, par exemple 26 degrés Celsius. Vérifiez les plaques une fois par jour. Sélectionnez et isolez les colonies présentant des morphologies de croissance distinctes sur de nouvelles plaques à l’aide de la technique de la plaque strie.
Répétez cette étape autant de fois que nécessaire pour avoir des colonies pures qui poussent sur les plaques. Stockez les isolats à quatre degrés Celsius ou en glycérol comme décrit dans le manuscrit. Pour effectuer le test de capacité de dégradation EE2, choisissez une seule colonie dans les assiettes fraîches et inoculez en deux millilitres de milieu LB stérile dans un tube.
Dans le cas où il s’agit d’un stock de glycérol, prendre 10 microlitres de stock bactérien glycérol et stries sur les plaques d’agar LB. Incuber à 24 à 28 degrés Celsius pendant la nuit pour avoir une seule colonies de plus en plus. Placez le tube contenant du LB moyen incliné sous agitation constante à 150 fois g à 24 à 28 degrés Celsius pendant la nuit.
Après la croissance bactérienne, pelleter les cellules en les centrifugant à 8000 fois g pendant huit minutes à température ambiante. Jeter le surnatant. Pour laver le bouillon LB restant, ajouter deux millilitres d’eau salée pour résuspendre les cellules.
Répétez le lavage deux fois pour garantir qu’il n’y a aucune trace de source de carbone. Inoculer les cellules lavées et résuspendus dans le milieu de culture minimum Bushnell Haas contenant EE2 comme seule source de carbone. Évaluer la croissance bactérienne par densité optique à 600 nanomètres et les unités de formation de notre colonie sur le milieu de l’agar LB après 16 à 72 heures d’incubation.
Pour préparer un minimum de supports contenant une fraction soluble dans l’huile et l’eau et une fraction insoluble huile-eau comme seule source de carbone, ajoutez du pétrole brut de 1 à 2 % à 500 millilitres d’eau distillée stérile dans un flacon filtrant contenant une valve sur le fond. Gardez le flacon sous agitation constante à 24 à 28 degrés Celsius à 150 fois g pendant 48 heures. Après cela, placez le flacon sur une surface stable et attendez 10 à 20 minutes pour permettre à la fraction soluble et insoluble de se séparer.
Ouvrez ensuite le flacon de filtre inférieur pour transférer la fraction soluble huile-eau dans un nouveau flacon stérile, ce qui permet d’économiser la fraction insoluble huile-eau. Ensuite, préparer deux bouteilles de Bushnell Haas agar minimum moyen. Autoclave-le.
Combinez avec la fraction soluble huile-eau comme seule source de carbone à faire 500 millilitres de milieu d’agar. Faites de même avec la fraction insoluble huile-eau et transférez environ 25 millilitres de chaque milieu sur des boîtes de Pétri individuelles. Pour isoler les bactéries dégradantes à l’huile, réutilisez des échantillons préalablement dilués et pipette 100 microlitres de chaque dilution sur les boîtes de Pétri contenant du milieu d’agar et assiettez-les.
N’oubliez pas de garder des contrôles négatifs pour vos assiettes. Incuber les plats pendant un à trois jours à la température cible et répéter les procédures d’isolement comme précédemment. Dans ce protocole, les micro-organismes ont été isolés de différentes sources d’eau et nubbines coralliennes présentant des caractéristiques de BMC putatives et capables de dégrader différentes classes de contaminants.
À l’aide d’échantillons d’eau prélevés dans une station d’épuration des eaux usées obtenues auprès du Centre expérimental d’assainissement de l’environnement de l’Université fédérale de Rio de Janeiro, 33 souches bactériennes capables de dégrader eE2 ont été isolées. En outre, en utilisant la technique pour sélectionner les bactéries qui dégradent l’huile, 20 souches capables de dégrader à la fois la fraction soluble dans l’huile-eau et la fraction insoluble huile-eau ont été isolées. Des caractéristiques putatives de BMC ont été examinées dans des micro-organismes, parmi eux une souche présentant l’activité antagoniste forte contre l’agent pathogène corallien Vibrio cholerae lyticus, des souches capables de dégrader l’urée, un bon producteur de catalase, et des micro-organismes présentant des gènes potentiellement bénéfiques ont été trouvés.
En utilisant à la fois la biorémédiation et l’inoculation BMC, il a été possible de prédire les coraux à partir des impacts de l’exposition au pétrole. Un consortium de bioremédiateurs pétroliers PBMC isolé du corail a été inoculé sur des nubbines coralliennes exposées à 1% d’huile. Il a montré une capacité photochimique mieux préservée par rapport à la santé des coraux sans inoculation.
Ne laissez pas les échantillons à température ambiante trop longtemps. Sinon, la communauté microbienne peut changer et les microbes liés à la maladie peuvent en dépasser d’autres. Le pétrole brut est toxique.
S’il vous plaît assurez-vous d’utiliser l’équipement de protection individuelle approprié lorsque vous travaillez avec ceci ou tout autre contaminant que vous décidez d’utiliser. Cette technique a ouvert une voie novatrice dans le domaine de la restauration des coraux et de la bioremédiation des océans peut potentiellement être utilisée pour minimiser les impacts économiques, écologiques et sociaux causés par le changement mondial.
