Le protocole décrit une approche simplifiée pour le criblage et l’isolement des microbes résistants aux métaux lourds provenant de sources géothermiques. Cette approche représente un domaine de recherche d’intérêt croissant dans le monde entier pour une application dans le domaine de la biodétection et de la bioremédiation. La méthode qui y est décrite peut être facilement modifiée pour isoler les microbes de diverses sources environnementales telles que l’eau, la nourriture, le sol ou les sédiments.
La concentration minimale inhibitrice pour identifier un microbe résistant est une stratégie rapide pour caractériser les nouvelles espèces ou souches. Ce protocole est facile à exécuter et ne nécessite que des compétences manuelles et de l’expérience avec les techniques de microbiologie de base. Pour commencer, inoculez deux grammes d’échantillon prélevé dans 50 microlites de milieu Luria-Bertani fraîchement préparé avec un pH de quatre ou sept.
Incuber cet échantillon à la température du site d’échantillonnage à plus ou moins cinq degrés Celsius. Plaquez 200 microlitres de l’échantillon sur la gélose Luria-Bertani avec un pH de quatre ou sept et maintenez-la dans un état statique à 55 ou 60 degrés Celsius pendant 48 heures. Après l’incubation, isolez les colonies individuelles et répétez ce cycle de placage de stries au moins trois fois.
Pour préparer un millilitre de stock cellulaire congelé, ajoutez 20% de glycérol aux cellules cultivées pendant la nuit. Utilisez un mélange d’acétone et de glace carbonique pour une congélation rapide. Pour préparer un inoculum à partir d’un stock de glycérol, inoculez 50 microlitres dans 50 millilitres de Luria-Bertani.
Pour obtenir un profil de croissance, diluer cette préculture dans 10 microlitres de Luria-Bertani. Pour ajuster la densité optique à 0,1, ajoutez 600 nanomètres. Cultivez ces cellules pendant 16 heures à 55 ou 60 degrés Celsius dans le shaker orbital.
Mesurez la densité optique à 600 nanomètres à des intervalles de 30 minutes. Courbe à partir de ces données avec le temps sur l’axe X et la densité optique à 600 nanomètres sur l’axe Y. Tracer des courbes de croissance similaires avec un pH variable du milieu de culture, afin de déterminer le pH optimal pour les conditions de laboratoire, inoculer l’isolat strié du stock de glycérol dans 50 microlitres de milieu Luria-Bertani et incuber pendant la nuit.
Centrifugez cette culture cultivée pendant la nuit pendant 10 minutes à 5 000 fois G, puis jetez le surnageant et récoltez la palette de culture. Préparer 10 millilitres de tampon de lyse bactérienne composé de 20 millimolaires Tris-HCL, deux millimolaires EDTA, 1,2% Triton X-100 et 20 milligrammes par millilitre lysosome immédiatement avant utilisation. Remettez la pastille dans 180 microlitres de tampon de bacterialyse.
Extraction de l’ADN génomique comme indiqué dans le kit de purification et mesure de l’ADN génomique et de sa pureté par UV-Vis. Pour évaluer la pureté, déterminez les rapports de densité optique de 260 à 280 et de 260 à 230. Évaluez l’intégrité de l’ADN génomique en chargeant 200 nanogrammes de chaque échantillon sur un gel d’agarose à 0,8 % et en comparant la distribution de taille à un marqueur moléculaire de taille et de poids.
Cultivez l’isolat du stock de glycérol dans 200 millilitres de Luria-Bertani dans des conditions optimales de pH et de température. Diluer chaque préculture dans cinq millilitres de milieu Luria-Bertani dans 50 millilitres de tubes en polypropylène contenant des concentrations croissantes de métaux lourds et d’antibiotiques pour obtenir une densité optique de 0,1 à 600 nanomètres. Cultivez les cellules pendant 16 heures sur un agitateur orbital avec 180 tours par minute à 55 ou 60 degrés Celsius.
Calculer la concentration minimale inhibitrice pour les antibiotiques ou les métaux lourds en identifiant les valeurs de concentration dans les tubes où la croissance microbienne ne se produit pas. Vérifier que la concentration est inhibitrice et non létale pour les cellules en plaquant 200 microlitres de la culture cultivée à des concentrations inhibitrices minimales sur des plaques de gélose Luria-Bertani et en vérifiant la présence de colonies après une incubation nocturne. Ce protocole a été utilisé pour tester des échantillons bactériens de la région de Piscarelli, un environnement géothermique sulfurique acide La caractérisation phénotypique des micro-organismes isolés a montré que l’isolat a une tolérance plus élevée à l’arséniate et au vanadate et est résistant au cadmium.
Les données comparatives suggèrent que l’isolat un a une forte résistance à l’arsenic pentavalent tandis que l’isolat deux a une résistance à l’arsenic trivalent. Les tests de résistance aux antibiotiques ont montré que l’isolat est très sensible à tous les antibiotiques testés, même lorsque de faibles concentrations ont été utilisées. En revanche, l’isolat deux est résistant à tous les antibiotiques testés à l’exception du chloramphénicol et de la tétracycline.
Le micro-organisme a probablement acquis une résistance aux antibiotiques en raison de mutations aléatoires ou d’un transfert horizontal de gènes représentant un avantage sélectif dans des conditions environnementales extrêmes. Cette étude démontre l’utilité de telles méthodes pour sélectionner les micro-organismes environnementaux qui peuvent inactiver les polluants et les convertir en produits inoffensifs.
