Ce protocole démontre que nous pouvons maintenant déterminer l’effet des inhibiteurs migrastatiques en détail dans les modèles de cancer 3D. Le principal avantage est la facilité et l’approche tout-en-un avec laquelle cette technique peut être effectuée. Cette technique permet l’évaluation des médicaments migrastatiques dans la recherche sur le cancer dans un cadre 3D, permettant l’essai de médicaments dans un environnement plus tumoral pertinent.
Cette méthode peut être appliquée au dépistage des médicaments cytotoxiques dans le cancer ou, par exemple, pour évaluer l’effet des radiations sur la prolifération du cancer et la migration cellulaire. Il est utile de pratiquer l’étape d’enlèvement moyen et le remplacement de collagène avec des plaques ordinaires de 96 puits pour devenir confiant. En outre, la formation sur un microscope confocal est essentielle.
La démonstration visuelle de cette technique est essentielle pour que les chercheurs comprennent la manipulation délicate requise des sphéroïdes et leur utilisation dans la microscopie confoccale. Le premier jour de l’expérimentation, ont le milieu de culture standard, dans ce cas, U251, prêt pour la ligne cellulaire appropriée. Dans une hotte de culture tissulaire, ajouter 0,5 millilitres de trypsine dans la culture pour trypsiniser les cellules cancéreuses.
Comptez les cellules cancéreuses sur un hémocytomètre, et diluer à une concentration de cinq fois 10 à la troisième cellule par millilitre. Gardez les suspensions cellulaires dans des tubes universels clairement étiquetés et stériles. Resuspendez les cellules par inversion douce pour éviter l’agglutination cellulaire.
Utilisez une pipette pour ajouter 200 microlitres de la culture cellulaire à chaque puits dans une plaque de 96 puits. Ajouter 200 microlitres de 1X PBS à chaque puits vide pour éviter l’évaporation. Incuber les cellules dans un incubateur à 37 degrés Celsius.
Après 24 heures, vérifiez les cellules par microscopie à champ lumineux. Les lignées cellulaires telles que les lignées cellulaires cancéreuses du gliome forment des sphéroïdes au fond du puits dans les 24 heures. Incuber les sphéroïdes pendant encore 48 heures pour permettre à une architecture cellulaire 3D de se former.
Le troisième jour, placez du collagène, un milieu de culture 5X, un hydroxyde de sodium molaire et un tube de 20 millilitres sur la glace. Ajouter soigneusement et lentement 10,4 millilitres de collagène froid dans le tube de culture réfrigéré. Évitez les bulles.
Ajouter ensuite délicatement 1,52 millilitres de milieu de culture 5X stérile froid. Évitez les bulles. Juste avant l’utilisation, ajouter délicatement 72 microlitres d’hydroxyde de sodium stérile froid et un molaire, et garder la solution sur la glace.
Mélanger délicatement en pipetage et en évitant les bulles. Un mélange efficace conduit à un changement de couleur du rouge au rouge orangé dans le milieu. Laisser le mélange sur la glace jusqu’à utilisation.
Ensuite, pour enlever 190 microlitres de supernatant de la plaque de 96 puits préparée le premier jour, utilisez une pipette à un angle vers le côté du puits. Veillez à ne pas déranger les sphéroïdes qui se sont formés au fond du puits. Ajouter délicatement 100 microlitres du mélange de collagène à chaque puits, en descendant le côté du puits.
Évitez les bulles et toute perturbation sphéroïde. Conservez tout mélange de collagène restant dans le tube de 20 millilitres à température ambiante pour évaluer la polymérisation. Incuber la plaque dans l’incubateur pendant au moins 10 minutes pour permettre au collagène de polymériser.
Lorsque les restes de collagène deviennent semi-solubles et éponge-like, les sphéroïdes sont prêts à être traités avec inhibiteur. Ajouter les inhibiteurs à la concentration de 2X à cinq millilitres de milieu de culture. Pipette 100 microlitres du milieu doucement sur le côté de chaque puits pour éviter les perturbations sphéroïdes.
Observez et imagez chaque sphéroïde par microscopie à champ lumineux à des moments de zéro heure, 24 heures, 48 heures et 72 heures pour évaluer l’activité médicamenteux. Ensuite, retournez la plaque à l’incubateur. Maintenant, placez la plaque dans une hotte de culture tissulaire, et remplacez doucement le supernatant par 100 microlitres de 1X PBS.
Prenez soin de ne pas déranger le sphéroïde, et éviter de toucher le collagène. Répétez cette étape de lavage trois fois de plus. Retirer le lavage final dans chaque puits et remplacer par 100 microlitres de formaldéhyde de 4 % en 1X PBS.
Déposer la plaque de 96 puits sur un banc de laboratoire, couvrir de papier d’aluminium et laisser pendant 24 heures à température ambiante. Le lendemain, retirez soigneusement le formaldéhyde et remplacez-le par 1X PBS. Répétez ce lavage trois fois de plus.
Ensuite, remplacez le lavage 1X PBS par 100 microlitres de solution Triton X-100 fraîchement préparée. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Entre-temps, préparer la solution de blocage avec 50 millilitres de 1X PBS et 05% de lait écrémé en poudre dans un tube de 50 millilitres, et bien mélanger.
Après 30 minutes, retirer le Triton X-100 et laver trois fois avec 1X PBS. Ajouter 100 microlitres de la solution de blocage à chaque puits et incuber pendant 15 minutes. Ensuite, diluer l’anti-souris IgG anticorps à base de tubuline acétylated dans le tampon de blocage à un rapport de un à 100.
Centrifugeuse le mélange tampon primaire anticorps bloquant pendant cinq minutes à 15, 682 fois g. Retirez soigneusement la solution de blocage dans chaque puits et ajoutez de 25 à 50 microlitres du supernatant tampon bloquant les anticorps du tube. Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant une heure.
Ensuite, retirez la solution d’anticorps de chaque puits et lavez-la trois fois avec 100 microlitres de 1X PBS. Diluer l’anticorps secondaire dans le tampon de blocage à la concentration recommandée en plus de toute tache fluorescente supplémentaire. Encore une fois, centrifugeuse de la solution d’anticorps secondaire pendant cinq minutes à 15, 682 fois g.
Retirez la solution de blocage de chaque puits et ajoutez de 25 à 50 microlitres du supernatant anticorps secondaire. Incuber dans l’obscurité pendant 1 1/2 heure à température ambiante. Retirez la solution secondaire de colorant anticorps et lavez-la trois fois avec 1X PBS, 100 microlitres par puits.
Soulevez soigneusement les bouchons individuels de collagène par aspiration avec une pipette en plastique de 200 microlitres sur le centre d’une glissière en verre. Ajouter une goutte d’un montage approprié pour couvrir le bouchon de collagène. Placez un coverslip sur le dessus de l’échantillon et rangez la lame à température ambiante dans l’obscurité.
La technologie sphéroïde tridimensionnelle fait progresser la compréhension des interactions médicament-tumeur parce qu’elle est plus représentative de l’environnement spécifique au cancer. Dans cette étude, des effets anti-ou pro-migratoires potentiels ont été détectés. Ceci est particulièrement visible dans KNS42 avec apparemment aucune migration dans le contrôle ou les sphéroïdes traités.
La mort cellulaire a été observée à la concentration inhibitrice la plus élevée de 10 micromolaires. La fragmentation nucléaire et les cellules migrantes étaient évidentes dans les cellules U251. Les sphéroïdes de cellules U251 ont eu des pointes rayonnant loin du sphéroïde original, avec l’arrondi croissant de cellules dans les cellules apparentes avec la concentration croissante d’inhibiteur.
Des microtubules effondrés et la fragmentation nucléaire ont été observés dans KNS42. Les saillies sheetlike avec des pointes de cellule simple indiquent la migration de KNS42. À la concentration d’inhibiteur la plus basse, ce phénotype a été prononcé mais a été perdu avec la concentration croissante d’inhibiteur.
Il est crucial de laisser tous les reagents sur la glace jusqu’à ce qu’ils soient prêts. Sinon, le collagène commence à polymériser avant qu’il n’ait été ajouté aux sphéroïdes. Il est possible de quantifier les images générées par la microscopie confoccale pour évaluer les effets, par exemple, des médicaments migrastatiques sur la morphologie cellulaire.
Il nous a permis, pour la première fois, de confirmer l’effet de l’inhibiteur migrastatique MI-192 sur les niveaux d’acétylation microtubule et d’explorer cette question plus en termes de migration cellulaire. Un soin supplémentaire doit être pris lors de la manipulation du formaldéhyde pour l’étape de fixation. Les lignes directrices habituelles en matière de santé et de sécurité s’appliquent.
