Dieses Protokoll zeigt, dass wir nun die Wirkung von migrastatischen Inhibitoren in 3D-Krebsmodellen im Detail bestimmen können. Der Hauptvorteil ist die Leichtigkeit und All-in-One-Ansatz, mit dem diese Technik durchgeführt werden kann. Diese Technik ermöglicht die Beurteilung von migrastatischen Medikamenten in der Krebsforschung in einer 3D-Umgebung, so dass die Prüfung von Medikamenten in einer tumorumgebungsrelevanten Umgebung ermöglicht wird.
Diese Methode kann auf Tests von zytotoxischen Medikamenten bei Krebs angewendet werden oder beispielsweise, um die Auswirkungen von Strahlung auf die Krebsproliferation und zellmigration zu bewerten. Es ist nützlich, den mittleren Entfernungsschritt und Kollagenersatz mit gewöhnlichen 96-Well-Platten zu üben, um selbstbewusst zu werden. Auch das Training an einem konfokalen Mikroskop ist unerlässlich.
Die visuelle Demonstration dieser Technik ist für die Forscher entscheidend, um den erforderlichen, zarten Umgang mit den Sphäroiden und deren Einsatz in der konfokalen Mikroskopie zu verstehen. Am ersten Tag des Experimentierens, haben Sie das Standardkulturmedium, in diesem Fall U251, bereit für die entsprechende Zelllinie. In einer Gewebekulturhaube, fügen Sie 0,5 Milliliter Trypsin in die Kultur, um die Krebszellen zu trypsinisieren.
Zählen Sie die Krebszellen auf einem Hämozytometer und verdünnen Sie die Konzentration von fünfmal 10 bis zu den dritten Zellen pro Milliliter. Bewahren Sie die Zellsuspensionen in klar beschrifteten, sterilen Universalröhren auf. Setzen Sie die Zellen durch sanfte Inversion wieder aus, um Zellverklumpungen zu vermeiden.
Verwenden Sie eine Pipette, um 200 Mikroliter der Zellkultur zu jedem Brunnen in einer 96-Well-Platte hinzuzufügen. Fügen Sie 200 Mikroliter 1X PBS zu jedem leeren Brunnen hinzu, um Verdunstung zu vermeiden. Inkubieren Sie die Zellen in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius.
Überprüfen Sie nach 24 Stunden die Zellen durch Hellfeldmikroskopie. Zelllinien wie Gliom-Krebszelllinien bilden innerhalb von 24 Stunden Sphäroide im Boden des Brunnens. Inkubieren Sie die Sphäroide für weitere 48 Stunden, damit sich eine 3D-Zellarchitektur bilden kann.
Legen Sie am dritten Tag Kollagen, 5X Kulturmedium, ein-molares Natriumhydroxid und eine 20-Milliliter-Röhre auf Eis. Sorgfältig und langsam 10,4 Milliliter kaltes Kollagen in die gekühlte Kulturröhre geben. Vermeiden Sie Blasen.
Dann fügen Sie vorsichtig 1,52 Milliliter kalte sterile 5X Kulturmedium. Vermeiden Sie Blasen. Kurz vor Gebrauch 72 Mikroliter kaltes steriles Natriumhydroxid mit einem Molaren vorsichtig hinzufügen und die Lösung auf Eis halten.
Mischen Sie sanft durch Pipettieren und Vermeidung von Blasen. Effizientes Mischen führt zu einem Farbwechsel von Rot zu Orange-Rot im Medium. Lassen Sie die Mischung auf Eis, bis sie verwendet wird.
Als nächstes, um 190 Mikroliter Überstand aus der 96-Well-Platte am ersten Tag vorbereitet zu entfernen, verwenden Sie eine Pipette in einem Winkel zur Seite des Brunnens. Achten Sie sehr darauf, die Sphäroide, die sich im Boden des Brunnens gebildet haben, nicht zu stören. Fügen Sie vorsichtig 100 Mikroliter der Kollagenmischung zu jedem Brunnen hinzu und pfeifen Sie die Seite des Brunnens hinunter.
Vermeiden Sie Blasen und Sphäroidstörungen. Bewahren Sie die verbleibende Kollagenmischung in der 20-Milliliter-Röhre bei Raumtemperatur auf, um die Polymerisation zu bewerten. Inkubieren Sie die Platte im Inkubator für mindestens 10 Minuten, damit das Kollagen polymerisieren kann.
Wenn das übrig gebliebene Kollagen halbfest und schwammartig wird, sind die Sphäroide bereit, mit Inhibitor behandelt zu werden. Fügen Sie die Inhibitoren bei 2X Konzentration auf fünf Milliliter Kulturmedium. Pipette 100 Mikroliter des Mediums sanft an der Seite jedes Brunnens, um Sphäroidstörungen zu vermeiden.
Beobachten und abbilden Sie jedes Sphäroid durch Hellfeldmikroskopie zu Zeiten von null Stunden, 24 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden, um die Drogenaktivität zu bewerten. Dann kehren Sie die Platte zum Inkubator zurück. Legen Sie nun die Platte in eine Gewebekulturhaube und ersetzen Sie den Überstand vorsichtig durch 100 Mikroliter 1X PBS.
Achten Sie darauf, das Sphäroid nicht zu stören, und vermeiden Sie es, das Kollagen zu berühren. Wiederholen Sie diesen Waschschritt noch dreimal. Entfernen Sie die Endwäsche in jedem Brunnen, und ersetzen Sie durch 100 Mikroliter 4%Formaldehyd in 1X PBS.
Die 96-Well-Platte auf eine Laborbank legen, mit Folie abdecken und 24 Stunden bei Raumtemperatur lassen. Entfernen Sie am nächsten Tag sorgfältig das Formaldehyd und ersetzen Sie es durch 1X PBS. Wiederholen Sie diese Wäsche noch dreimal.
Ersetzen Sie dann die 1X PBS-Waschanlage durch 100 Mikroliter frisch zubereitete Triton X-100 Lösung. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. In der Zwischenzeit die Sperrlösung mit 50 Millilitern 1X PBS und 05% Magermilchpulver in einem 50-Milliliter-Rohr vorbereiten und gründlich vermischen.
Nach 30 Minuten den Triton X-100 entfernen und dreimal mit 1X PBS waschen. Fügen Sie 100 Mikroliter der Blockierlösung zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten lang. Als nächstes verdünnen Anti-Maus-IgG-Acetylaced-Tubulin-Antikörper im Blockierpuffer im Verhältnis eins zu 100.
Zentrifugieren Sie den primären Antikörper-Blockierenden Puffermix für fünf Minuten bei 15, 682 mal g. Entfernen Sie vorsichtig die Blockierlösung in jedem Brunnen, und fügen Sie 25 bis 50 Mikroliter des Antikörperblockierpuffers aus dem Rohr hinzu. Inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für eine Stunde.
Dann entfernen Sie die Antikörperlösung aus jedem Brunnen und waschen Sie dreimal mit 100 Mikroliter 1X PBS. Sekundärantikörper im Sperrpuffer in der empfohlenen Konzentration zusätzlich zu zusätzlichen fluoreszierenden Flecken verdünnen. Zentrifugieren Sie die sekundäre Antikörperlösung für fünf Minuten bei 15, 682 mal g.
Entfernen Sie die Blockierlösung aus jedem Brunnen, und fügen Sie 25 bis 50 Mikroliter des sekundären Antikörperüberstandes hinzu. Inder in der Dunkelheit für 1 1/2 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie die sekundäre Antikörper-Farbstoff-Lösung, und waschen Sie dreimal mit 1X PBS, 100 Mikroliter pro Brunnen.
Heben Sie einzelne Kollagenstecker vorsichtig durch Absaugen mit einer 200-Mikroliter-Pipette aus Kunststoff auf die Mitte einer Glasrutsche. Fügen Sie einen Tropfen eines geeigneten Reitmittels hinzu, um den Kollagenstecker zu bedecken. Positionieren Sie einen Coverslip auf der Oberseite der Probe, und lagern Sie die Folie bei Raumtemperatur im Dunkeln.
Die dreidimensionale Sphäroidtechnologie fördert das Verständnis von Wechselwirkungen zwischen Medikamenten und Tumoren, da sie repräsentativer für die krebsspezifische Umgebung ist. In dieser Studie wurden potenzielle anti- oder pro-migrationsfreundliche Effekte nachgewiesen. Besonders auffällig ist dies bei KNS42 ohne scheinbar keine Migration in den kontrollierbaren oder behandelten Sphäroiden.
Der Zelltod wurde bei der höchsten Inhibitorkonzentration von 10 Mikromolaren beobachtet. Nukleare Fragmentierung und wandernde Zellen waren in U251-Zellen offensichtlich. U251-Zellsphäride hatten Spikes, die vom ursprünglichen Sphäroid wegstrahlten, wobei eine zunehmende Zellrundung in Zellen mit zunehmender Inhibitorkonzentration sichtbar wurde.
Kollabierte Mikrotubuli und nukleare Fragmentierung wurden in KNS42 beobachtet. Blattartige Vorsprünge mit einzelzelligen Spitzen weisen auf die KNS42-Migration hin. Bei der niedrigsten Inhibitorkonzentration war dieser Phänotyp ausgeprägt, ging aber mit zunehmender Inhibitorkonzentration verloren.
Es ist wichtig, alle Reagenzien auf Eis zu lassen, bis sie fertig sind. Andernfalls beginnt das Kollagen zu polymerisieren, bevor es den Sphäroiden hinzugefügt wurde. Es gibt Raum, die durch konfokale Mikroskopie erzeugten Bilder zu quantifizieren, um die Auswirkungen beispielsweise von migrastatischen Medikamenten auf die Zellmorphologie zu bewerten.
Es ermöglichte uns zum ersten Mal, die Wirkung des migrastatischen Inhibitors MI-192 auf die Mikrotubuli-Acetylierung zu bestätigen und dies im Hinblick auf die Zellmigration weiter zu erforschen. Beim Umgang mit Formaldehyd für den Fixierungsschritt ist besondere Vorsicht geboten. Es gelten die üblichen Gesundheits- und Sicherheitsrichtlinien.
