פרוטוקול זה מדגים כי עכשיו אנחנו יכולים לקבוע את ההשפעה של מעכבי מיגרסטטי בפירוט במודלים סרטן 3D. היתרון העיקרי הוא הגישה הקלה והתמידית שבה ניתן לבצע טכניקה זו. טכניקה זו מאפשרת הערכה של תרופות מיגרסטטיות בחקר הסרטן בסביבה תלת מימדית, ומאפשרת בדיקה של תרופות בסביבה רלוונטית יותר לסביבת הגידול.
שיטה זו עשויה להיות מיושמת על בדיקות של תרופות cytotoxic בסרטן או, למשל, כדי להעריך את ההשפעה של קרינה על התפשטות סרטן הגירת תאים. כדאי לתרגל את שלב ההסרה הבינוני והחלפת קולגן עם צלחות רגילות של 96 בארות כדי להיות בטוחים. כמו כן, אימון על מיקרוסקופ קונפוקל הוא חיוני.
הדגמה חזותית של טכניקה זו היא קריטית עבור החוקרים להבין את הטיפול העדין הנדרש של כדוריות ושימוש במיקרוסקופיה קונפוקאלית. ביום הראשון של הניסויים, יש את מדיום התרבות הסטנדרטי, במקרה זה, U251, מוכן לקו התא המתאים. במכסה המנוע של תרבות הרקמה, להוסיף 0.5 מיליליטר של טריפסין לתוך התרבות כדי לנסות את התאים הסרטניים.
לספור את התאים הסרטניים על hemocytometer, ולדלל לריכוז של חמש פעמים 10 לתאים השלישיים למיליליטר. שמור את מתלי התא בצינורות אוניברסליים סטריליים מסומנים בבירור. תן שימוש חוזר בתאים על ידי היפוך עדין כדי למנוע גוש תאים.
השתמש פיפטה להוסיף 200 microliters של תרבות התא לכל באר בצלחת 96 היטב. הוסף 200 מיקרוליטרים של PBS 1X לכל באר ריקה כדי למנוע אידוי. להטמיר את התאים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס.
לאחר 24 שעות, בדוק את התאים על ידי מיקרוסקופיה שדה בהיר. קווי תאים כגון קווי תאים סרטניים glioma טופס כדוריות בתחתית הבאר בתוך 24 שעות. הדגירה spheroids במשך 48 שעות נוספות כדי לאפשר ארכיטקטורה סלולרית 3D להיווצר.
ביום השלישי, מניחים קולגן, מדיום תרבות 5X, נתרן הידרוקסיד אחד טוחן, וצינור אחד 20 מיליליטר על קרח. בזהירות ולאט לאט להוסיף 10.4 מיליליטר של קולגן קר לתוך צינור התרבות המצוננת. הימנע בועות.
לאחר מכן, מוסיפים בעדינות 1.52 מיליליטר של מדיום תרבות סטרילי קר 5X. הימנע בועות. ממש לפני השימוש, מוסיפים בעדינות 72 מיקרוליטרים של נתרן הידרוקסיד סטרילי קר, שומרים את הפתרון על הקרח.
מערבבים בעדינות על ידי צינורות והימנעות בועות. ערבוב יעיל מוביל לשינוי צבע מ אדום לכתום-אדום במדיום. השאירו את התערובת על הקרח עד לשימוש.
לאחר מכן, כדי להסיר 190 מיקרוליטרים של על-טבעיים מהצלחת בת 96 הבאר שהוכנה ביום הראשון, השתמשו בפיפסה בזווית לכיוון צד הבאר. היזהר מאוד לא להפריע לספרואידים שנוצרו בתחתית הבירה. מוסיפים בעדינות 100 מיקרוליטרים של תערובת הקולגן לכל באר, צינורות לאורך הצד של באר.
הימנע בועות וכל הפרעה כדורית. שמור על כל תערובת קולגן שנותרה בצינור 20 מיליליטר בטמפרטורת החדר כדי להעריך את הפולימריזציה. אין לארוב את הצלחת באינקובטור למשך 10 דקות לפחות כדי לאפשר לקולאגן לעשות פולימריזציה.
כאשר שאריות הקולגן הופכות חצי סולידיות וספוגיות, הכדורידים מוכנים לטיפול במעכבים. מוסיפים את המעכבים בריכוז פי 2 לחמישה מיליליטר של מדיום תרבותי. פיפטה 100 מיקרוליטרים של המדיום בעדינות לאורך הצד של כל באר, כדי למנוע הפרעה כדורית.
שימו לב ודמיינו כל ספרואיד על ידי מיקרוסקופיה של שדה בהיר בזמנים של אפס שעה, 24 שעות, 48 שעות ו-72 שעות להערכת פעילות התרופה. לאחר מכן, להחזיר את הצלחת לאנקובטור. עכשיו, מניחים את הצלחת במכסה המנוע של תרבות הרקמה, ומחליפים בעדינות את העל-טבעי ב-100 מיקרוליטרים של 1X PBS.
יש לדאוג לא להפריע לספרואיד, ולהימנע מנגיעה קולגן. חזור על שלב שטיפה זה שלוש פעמים נוספות. הסירו את הכביסה הסופית בכל באר, והחליפו ב-100 מיקרוליטרים של 4% פורמלדהיד ב-1X PBS.
מניחים את צלחת 96 באר על ספסל מעבדה, לכסות בנייר כסף, ולהשאיר במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר. למחרת, להסיר בזהירות את פורמלדהיד, ולהחליף עם 1X PBS. חזור על שטיפה זו שלוש פעמים נוספות.
לאחר מכן, החלף את לשטוף PBS 1X עם 100 microliters של פתרון טריטון X-100 מוכן טרי. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. בינתיים, הכינו את פתרון החסימה עם 50 מיליליטר של 1X PBS ו-05% אבקת חלב דל שומן בצינור של 50 מיליליטר, ומערבבים היטב.
לאחר 30 דקות, להסיר את טריטון X-100, ולשטוף שלוש פעמים עם 1X PBS. מוסיפים 100 מיקרוליטרים של פתרון החסימה לכל באר, ו דגירה במשך 15 דקות. לאחר מכן, לדלל נוגדן איג-אצטילין איג-עכבר אצטילטין במאגר החסימה ביחס של 1 עד 100.
צנטריפוגה תערובת חיץ חסימת הנוגדנים העיקרית במשך חמש דקות ב 15, 682 פעמים גרם. הסר בזהירות את פתרון החסימה בכל באר, והוסף 25 עד 50 מיקרוליטרים של מאגר חסימת הנוגדנים מהצינור. דגירה בחושך בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת.
לאחר מכן, להסיר את פתרון הנוגדנים מכל באר, ולשטוף שלוש פעמים עם 100 microliters של 1X PBS. לדלל נוגדן משני במאגר החסימה בריכוז המומלץ בנוסף לכתמים פלואורסצנטיים נוספים. שוב, צנטריפוגה פתרון הנוגדן המשני במשך חמש דקות ב 15, 682 פעמים גרם.
הסר את פתרון החסימה מכל באר, והוסף 25 עד 50 מיקרוליטרים של הנוגדן המשני. דגירה בחושך במשך 1 1/2 שעות בטמפרטורת החדר. הסר את פתרון צבע הנוגדנים המשני, ושטף שלוש פעמים עם 1X PBS, 100 מיקרוליטרים ל באר.
בזהירות להרים תקעים קולגן בודדים על ידי יניקה עם פיפט פלסטיק 200 מיקרוליטר למרכז מגלשת זכוכית. מוסיפים טיפה אחת של הר מתאים כדי לכסות את תקע הקולגן. מקם כיסוי מעל המדגם ואחסן את השקופית בטמפרטורת החדר בחושך.
טכנולוגיית ספרואיד תלת מימדי מקדמת את ההבנה של אינטראקציות בין סמים לגידולים כי היא מייצגת יותר את הסביבה הספציפית לסרטן. במחקר זה, אפקטים פוטנציאליים נגד או פרו נודדים זוהו. זה בולט במיוחד KNS42 עם לכאורה אין הגירה או בשליטה או טיפלו כדורידים.
מוות תאי נצפה בריכוז המעכב הגבוה ביותר של 10 מיקרומולרים. פיצול גרעיני ותאים נודדים ניכרו בתאי U251. U251 תאי spheroids היו קוצים מקרין מן הכדורית המקורית, עם הגדלת עיגול התא בתאים ניכר עם ריכוז מעכבי הגדלת.
מיקרוטובולים שקרסו ופיצול גרעיני נצפו ב- KNS42. בלטים דמויי גיליון עם קוצים של תא בודד מצביעים על העברת KNS42. בריכוז מעכב הנמוך ביותר, פנוטיפ זה היה מבוטא אבל אבד עם ריכוז מעכבי הגדלת.
זה חיוני להשאיר את כל הריג'ים על הקרח עד שהם מוכנים. אחרת, הקולגן מתחיל לפולימר לפני שהכל נוסף לספרואידים. יש היקף לכמת את התמונות שנוצרו על ידי מיקרוסקופיה confocal כדי להעריך את ההשפעות של, למשל, תרופות מיגרסטטיות על מורפולוגיה התא.
זה איפשר לנו, בפעם הראשונה, לאשר את ההשפעה של מעכב מיגרסטטי MI-192 על רמות אצטילציה microtubule ולחקור את זה עוד יותר במונחים של הגירת תאים. יש לנקוט בזהירות נוספת בעת טיפול בפורמלדהיד עבור שלב ההתקבעות. הנחיות הבריאות והבטיחות הרגילות חלות.
