Bu protokol, migrastatik inhibitörlerin etkisini 3Boyutlu kanser modellerinde ayrıntılı olarak belirleyebileceğimizi gösteriyor. En büyük avantajı, bu tekniğin uygulanabileceği kolaylık ve hepsi bir e-bir yaklaşımdır. Bu teknik, kanser araştırmalarında migrastatik ilaçların 3Boyutlu bir ortamda değerlendirilmesine olanak sağlayarak, ilaçların daha tümör ortamıyla ilgili bir ortamda test edilmesine olanak sağlar.
Bu yöntem kanserde sitotoksik ilaçların test edilmesi veya örneğin radyasyonun kanser proliferasyonu ve hücre göçü üzerindeki etkisini değerlendirmek için uygulanabilir. Bu emin olmak için sıradan 96-iyi plakalar ile orta kaldırma adım ve kollajen replasmanı uygulama yararlıdır. Ayrıca, konfokal mikroskop eğitimi esastır.
Bu tekniğin görsel gösterimi araştırmacılar ın küresel oidlerin gerekli hassas kullanımını ve konfokal mikroskopide kullanımını anlamaları açısından çok önemlidir. Denemenin ilk gününde, standart kültür ortamına sahip olun, bu durumda, U251, uygun hücre hattı için hazır. Bir doku kültürü başlık olarak, kanser hücrelerini denemek için kültüriçine tripsin 0.5 mililitre ekleyin.
Bir hemositometre üzerinde kanser hücrelerini saymak ve mililitre başına üçüncü hücrelere beş kez 10 bir konsantrasyon seyreltmek. Hücre süspansiyonlarını açıkça etiketlenmiş, steril evrensel tüplerde tutun. Hücre kümelenmesini önlemek için hücreleri nazik bir şekilde tersine çevirme ile yeniden askıya alın.
96 kuyulu bir plaka içinde her kuyuya hücre kültürünün 200 mikrolitre eklemek için bir pipet kullanın. Buharlaşmayı önlemek için her boş kuyuya 200 mikrolitre 1X PBS ekleyin. Hücreleri 37 derecede bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.
24 saat sonra, parlak alan mikroskobu ile hücreleri kontrol edin. Glioma kanser hücre hatları gibi hücre hatları 24 saat içinde kuyunun dibinde spheroids oluşturur. 3Boyutlu bir hücresel mimarinin oluşmasıiçin küresel leri 48 saat daha kuluçkaya yatırın.
Üçüncü gün, kollajen yerleştirin, 5X kültür orta, tek azılı sodyum hidroksit, ve buz üzerinde bir 20 mililitrelik tüp. Dikkatle ve yavaş yavaş soğutulmuş kültür tüpü içine soğuk kollajen 10.4 mililitre ekleyin. Kabarcıklar kaçının.
Sonra, yavaşça soğuk steril 5X kültür orta 1,52 mililitre ekleyin. Kabarcıklar kaçının. Kullanımdan hemen önce, 72 mikrolitre soğuk steril tek molar sodyum hidroksit ekleyin ve çözeltiyi buzda tutun.
Pipetleme ve kabarcıklar kaçınarak yavaşça karıştırın. Verimli karıştırma, ortamda kırmızıdan turuncu-kırmızıya doğru renk değişimine yol açar. Kullanıma kadar buz üzerinde karışımı bırakın.
Daha sonra, ilk gün hazırlanan 96 kuyulu plakadan 190 mikrolitre süpernatant çıkarmak için kuyunun yan tarafına doğru bir açıyla bir pipet kullanın. Kuyunun dibinde oluşan küreselleri rahatsız etmemek için çok dikkatli olun. Yavaşça her kuyuya kollajen karışımı 100 mikrolitre ekleyin, kuyunun yan aşağı borulama.
Kabarcıklar ve herhangi bir küresel rahatsızlık kaçının. Polimerizasyonu değerlendirmek için oda sıcaklığında 20 mililitrelik tüp içinde kalan kollajen karışımı tutun. Kollajenin polimerize olması için en az 10 dakika boyunca kuvözde plakayı kuluçkaya yatırın.
Kalan kollajen yarı katı ve sünger gibi hale geldiğinde, küresel ler inhibitör ile tedavi edilmesi için hazır. 2X konsantrasyonunda inhibitörleri beş mililitre kültür ortamına ekleyin. Pipet 100 mikrolitre orta hafifçe her kuyunun yan aşağı küresel rahatsızlık önlemek için.
İlaç aktivitesini değerlendirmek için her küresel spheroidi sıfır saat, 24 saat, 48 saat ve 72 saat gibi zamanlarda parlak alan mikroskobuyla gözlemleyin ve görüntüleyin. Sonra tabağı kuvöze geri ver. Şimdi, bir doku kültürü başlık plaka yerleştirin ve yavaşça 1X PBS 100 mikrolitre ile supernatant değiştirin.
Küresel balığı rahatsız etmemeye dikkat edin ve kollajene dokunmaktan kaçının. Bu yıkama adımLarını üç kez daha tekrarlayın. Her kuyudaki son yıkamayı çıkarın ve 1X PBS'de %4 formaldehit 100 mikrolitre ile değiştirin.
96 kuyulu plakayı bir laboratuvar bankına yerleştirin, folyo ile kaplayın ve oda sıcaklığında 24 saat bekletin. Ertesi gün formaldehiti dikkatlice çıkarın ve 1X PBS ile değiştirin. Bu yıkamayı üç kez daha tekrarlayın.
Ardından, 1X PBS yıkamayı 100 mikrolitre taze hazırlanmış Triton X-100 çözeltisi ile değiştirin. Oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yat. Bu arada, 50 mililitrelik bir tüpte 50 mililitre ve %05 yağsız süt tozu ile blokaj çözeltisini hazırlayın ve iyice karıştırın.
30 dakika sonra Triton X-100'ü çıkarın ve 1X PBS ile üç kez yıkayın. Her kuyuya 100 mikrolitre engelleme çözeltisi ekleyin ve 15 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, 1-100 oranında engelleme tampon anti-fare IgG asetillenmiş tubulin antikor seyreltmek.
Birincil antikor bloke tampon karışımını 15, 682 kez beş dakika santrifüj edin. Her kuyudaki engelleme çözeltisini dikkatlice çıkarın ve tüpten tampon süpernatantı bloke eden antikor un 25 ila 50 mikrolitresini ekleyin. Bir saat oda sıcaklığında karanlıkta kuluçka.
Daha sonra, her kuyudan antikor çözeltisini çıkarın ve 1X PBS 100 mikrolitre ile üç kez yıkayın. Herhangi bir ek floresan lekelere ek olarak önerilen konsantrasyonda bloke tampon ikincil antikor seyreltin. Yine, 15, 682 kez g beş dakika ikincil antikor solüsyonu santrifüj.
Engelleme çözeltisini her kuyudan çıkarın ve ikincil antikor süpernatantının 25 ila 50 mikrolitresini ekleyin. Oda sıcaklığında 1,5 saat karanlıkta kuluçkaya yat. İkincil antikor boya çözeltisini çıkarın ve her kuyuda 100 mikrolitre olan 1X PBS ile üç kez yıkayın.
Cam bir kaydırak merkezine plastik 200 mikrolitrelik pipet ile emme ile tek tek kollajen fişleri dikkatlice kaldırın. Kollajen fişi kapsayacak şekilde uygun bir montaj bir damla ekleyin. Bir kapak kaymasını numunenin üzerine yerleştirin ve slaydı karanlıkta oda sıcaklığında saklayın.
Üç boyutlu küresel teknoloji kansere özgü ortamın daha fazla temsilcisi olduğu için ilaç-tümör etkileşimleri anlayışı nı ilerletmektedir. Bu çalışmada, potansiyel anti-veya pro-göç etkileri tespit edildi. Bu özellikle KNS42'de kontrol veya tedavi edilen küresel lerde göç olmadığı görülür.
Hücre ölümü 10 mikromolar en yüksek inhibitör konsantrasyonu gözlendi. Nükleer parçalanma ve göç eden hücreler U251 hücrelerinde belirgindi. U251 hücre spheroidleri orijinal küresel uzak yayılan sivri vardı, artan inhibitör konsantrasyonu ile görünür hücrelerde hücre yuvarlama artan.
KNS42'de çöken mikrotübüller ve nükleer parçalanma gözlendi. Tek hücreli sivri yaprak benzeri çıkıntılar KNS42 geçişini gösterir. En düşük inhibitör konsantrasyonu, bu fenotip telaffuz edildi ama artan inhibitör konsantrasyonu ile kayboldu.
Hazır olana kadar tüm reaktifleri buzda bırakmak çok önemlidir. Aksi takdirde, kollajen tüm küresel lere eklendi önce polimerize başlar. Konfokal mikroskopi ile oluşturulan görüntüleri ölçmek için kapsam vardır, örneğin, hücre morfolojisi üzerinde migrastatik ilaçların etkilerini değerlendirmek için.
İlk defa migrastatik inhibitör MI-192'nin mikrotübül asetilasyon düzeyleri üzerindeki etkisini doğrulamamıza ve bunu hücre göçü açısından daha fazla araştırmamıza olanak sağladı. Fiksasyon adımı için formaldehit ele alırken ekstra dikkat edilmelidir. Her zamanki sağlık ve güvenlik yönergeleri geçerlidir.
