Este protocolo está demonstrando que agora podemos determinar o efeito dos inibidores migratáticos em detalhes em modelos de câncer 3D. A principal vantagem é a facilidade e abordagem all-in-one com a qual essa técnica pode ser realizada. Esta técnica permite a avaliação de medicamentos migratáticos em pesquisas de câncer em um ambiente 3D, permitindo o teste de drogas em um ambiente mais relevante para o tumor.
Este método pode ser aplicado ao teste de drogas citotóxica em câncer ou, por exemplo, para avaliar o efeito da radiação na proliferação do câncer e migração celular. É útil praticar a etapa de remoção média e substituição de colágeno com placas comuns de 96 poços para se tornar confiante. Além disso, o treinamento em um microscópio confocal é essencial.
A demonstração visual dessa técnica é fundamental para que os pesquisadores entendam o manejo delicado necessário dos esferoides e seu uso na microscopia confocal. No primeiro dia de experimentação, tenha o meio de cultura padrão, neste caso, U251, pronto para a linha celular apropriada. Em uma capa de cultura de tecido, adicione 0,5 mililitros de trippsina na cultura para tentarpsinizar as células cancerígenas.
Conte as células cancerígenas em um hemócito, e dilua para uma concentração de cinco vezes 10 para a terceira célula por mililitro. Mantenha as suspensões celulares em tubos universais claramente rotulados e estéreis. Resuspend as células por inversão suave para evitar a aglomeração celular.
Use uma pipeta para adicionar 200 microliters da cultura celular a cada poço em uma placa de 96 poços. Adicione 200 microliters de 1X PBS a cada poço vazio para evitar a evaporação. Incubar as células em uma incubadora a 37 graus Celsius.
Após 24 horas, verifique as células por microscopia de campo brilhante. Linhas celulares como linhas de células cancerígenas de glioma formam esferoides no fundo do poço dentro de 24 horas. Incubar os esferoides por mais 48 horas para permitir que uma arquitetura celular 3D se forme.
No terceiro dia, coloque colágeno, 5X de cultura média, hidróxido de sódio de um molar e um tubo de 20 mililitros no gelo. Adicione cuidadosamente e lentamente 10,4 mililitros de colágeno frio no tubo de cultura resfriado. Evite bolhas.
Em seguida, adicione suavemente 1,52 mililitros de meio de cultura 5X estéril a frio. Evite bolhas. Pouco antes do uso, adicione suavemente 72 microliters de hidróxido de sódio estéril frio e um molar, e mantenha a solução no gelo.
Misture suavemente por pipetar e evitar bolhas. A mistura eficiente leva a uma mudança de cor de vermelho para vermelho-laranja no meio. Deixe a mistura no gelo até usar.
Em seguida, para remover 190 microliters de supernacer da placa de 96 poços preparados no primeiro dia, use uma pipeta em um ângulo em direção ao lado do poço. Tenha muito cuidado para não perturbar os esferoides que se formaram no fundo do poço. Adicione suavemente 100 microliters da mistura de colágeno a cada poço, escoando pelo lado do poço.
Evite bolhas e qualquer perturbação esferoide. Mantenha qualquer mistura de colágeno restante no tubo de 20 mililitros à temperatura ambiente para avaliar a polimerização. Incubar a placa na incubadora por pelo menos 10 minutos para permitir que o colágeno polimerize.
Quando o colágeno restante se torna semisólida e esponja, os esferoides estão prontos para serem tratados com inibidor. Adicione os inibidores na concentração de 2X a cinco mililitros de meio de cultura. Pipeta 100 microliters do meio suavemente para baixo do lado de cada poço para evitar perturbação esferoide.
Observe e imagem cada esferoide por microscopia de campo brilhante em momentos de zero hora, 24 horas, 48 horas e 72 horas para avaliar a atividade medicamentosa. Em seguida, devolva a placa para a incubadora. Agora, coloque a placa em uma capa de cultura de tecido, e substitua suavemente o supernatante por 100 microliters de 1X PBS.
Tome cuidado para não perturbar o esferoide, e evite tocar no colágeno. Repita este passo de lavagem mais três vezes. Remova a lavagem final em cada poço e substitua por 100 microlitrais de 4% de formaldeído em 1X PBS.
Coloque a placa de 96 poços em um banco de laboratório, cubra com papel alumínio e deixe por 24 horas em temperatura ambiente. No dia seguinte, remova cuidadosamente o formaldeído e substitua por 1X PBS. Repita esta lavagem mais três vezes.
Em seguida, substitua a lavagem 1X PBS por 100 microliters de solução Triton X-100 recém-preparada. Incubar por 30 minutos em temperatura ambiente. Enquanto isso, prepare a solução de bloqueio com 50 mililitros de 1X PBS e 05% de leite em pó desnatado em um tubo de 50 mililitros, e misture bem.
Após 30 minutos, remova o Triton X-100 e lave três vezes com 1X PBS. Adicione 100 microliters da solução de bloqueio a cada poço e incubar por 15 minutos. Em seguida, diluir o anticorpo de tubulina acetilado anti-rato IgG no tampão de bloqueio a uma proporção de 1 a 100.
Centrifugar a mistura primária de tampão de bloqueio de anticorpos por cinco minutos a 15,682 vezes g. Remova cuidadosamente a solução de bloqueio em cada poço e adicione de 25 a 50 microliters do supernatante tampão de bloqueio de anticorpos do tubo. Incubar no escuro à temperatura ambiente por uma hora.
Em seguida, remova a solução de anticorpos de cada poço e lave três vezes com 100 microliters de 1X PBS. Diluir o anticorpo secundário no tampão de bloqueio na concentração recomendada, além de quaisquer manchas fluorescentes adicionais. Novamente, centrifugar a solução de anticorpos secundários por cinco minutos a 15,682 vezes g.
Remova a solução de bloqueio de cada poço e adicione 25 a 50 microliters do supernatante de anticorpos secundários. Incubar no escuro por 1 1/2 horas em temperatura ambiente. Remova a solução secundária de corante de anticorpos e lave três vezes com 1X PBS, 100 microliters por poço.
Levante cuidadosamente os plugues individuais de colágeno por sucção com uma pipeta de plástico de 200 microliter no centro de uma lâmina de vidro. Adicione uma gota de um montador adequado para cobrir o plugue de colágeno. Posicione uma mancha de cobertura em cima da amostra e armazene o slide à temperatura ambiente no escuro.
A tecnologia esferoide tridimensional está avançando na compreensão das interações medicamentosa-tumoral porque é mais representativa do ambiente específico do câncer. Neste estudo, foram detectados potenciais efeitos anti-ou pró-migratórios. Isto é especialmente perceptível no KNS42, aparentemente sem migração no controle ou nos esferoides tratados.
A morte celular foi observada na maior concentração inibidora de 10 micromolar. A fragmentação nuclear e as células migratórias foram evidentes nas células U251. Os esferoides de células U251 tinham picos irradiando para longe do esferoide original, com o aumento do arredondamento celular em células aparentes com a crescente concentração inibidora.
Microtúbulos colapsados e fragmentação nuclear foram observados no KNS42. Saliências de folha com picos de célula única indicam migração KNS42. Na menor concentração inibidora, este fenótipo foi pronunciado, mas foi perdido com o aumento da concentração inibidora.
É crucial deixar todos os reagentes no gelo até ficarem prontos. Caso contrário, o colágeno começa a polimerizar antes de tudo ser adicionado aos esferoides. Há escopo para quantificar as imagens geradas pela microscopia confocal para avaliar os efeitos de, por exemplo, drogas migratórias na morfologia celular.
Permitiu-nos, pela primeira vez, confirmar o efeito do inibidor migratático MI-192 nos níveis de acetilação de microtúbulos e explorar isso ainda mais em termos de migração celular. Deve-se tomar cuidado extra ao lidar com o formaldeído para a etapa de fixação. Aplicam-se as diretrizes habituais de saúde e segurança.
