Le but de cette recherche est d’évaluer la fonction plaquettaire dans des conditions physiologiques. Nous étudions spécifiquement la fonction plaquettaire à l’aide de dispositifs microfluidiques et de surfaces biologiques. Et en utilisant cette approche, nous avons pu répondre à des questions liées à la dysfonction plaquettaire et à la réanimation hémostatique pour des applications en médecine transfusionnelle.
Les tests actuels de la fonction plaquettaire testent souvent la capacité des plaquettes à s’agréger en réponse à un agoniste spécifique de leur choix. Les méthodes de détection peuvent inclure la transmission de la lumière ou l’impédance électrique, et ces tests peuvent utiliser des échantillons de processus et sont testés de manière stagnante. En utilisant cette approche microfluidique pour tester la fonction plaquettaire, nous intégrons la dynamique des fluides pour ajouter une pertinence physiologique.
La dynamique des fluides joue un rôle essentiel dans les mécanismes biologiques impliqués dans la fonction plaquettaire au cours de l’hémostase. Chez les patients hémorragiques, nous sommes particulièrement préoccupés par la fonction plaquettaire et les interventions thérapeutiques qui peuvent améliorer cette fonction pour de meilleurs résultats. En utilisant cette approche de test de la fonction plaquettaire, nous sommes en mesure de suivre les contributions de différentes populations de plaquettes dans une expérience et de débloquer un moyen d’évaluer les options thérapeutiques pour les traumatismes et autres conditions hémorragiques.
Pour commencer, versez la base en élastomère de silicone dans un plat de pesée. Ajoutez l’agent de durcissement du silicone dans un rapport de dix pour un et mélangez soigneusement pour assurer une bonne réticulation des chaînes de polymère de silicone. Placez le moule maître dans une boîte de Pétri et versez uniformément le PDMS non durci sur le moule.
Ensuite, placez la boîte de Pétri dans un dessiccateur sous vide pendant 30 minutes pour éliminer les bulles du mélange. Pour terminer le durcissement du PDMS, placez le moule dans un four réglé à 70 degrés Celsius pendant 90 minutes. Après un durcissement complet du PDMS, utilisez une lame de rasoir ou un scalpel pour découper le plâtre microfluidique.
Percez des trous sur les bords des canaux. Maintenant, placez la lame de verre et la coulée microfluidique avec le côté gravé vers le haut dans un nettoyeur plasma. Démarrez la pompe à vide et scellez la chambre.
Ensuite, réglez le nettoyeur plasma sur le réglage élevé et laissez la configuration dans le nettoyeur pendant 30 secondes. Après cela, éteignez le nettoyeur plasma et relâchez l’aspirateur. Pour lier la coulée et la lame de verre nettoyées au plasma, appuyez doucement sur les côtés qui étaient orientés vers le haut dans le nettoyeur plasma.
Placez le dispositif microfluidique dans un four ou sur une plaque chauffante à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes pour finaliser le processus de liaison. Maintenant, enduisez la chambre microfluidique avec un réactif de collagène fibrillaire équin de type un à travers une sortie désignée vers l’entrée désignée. Stockez l’appareil dans un récipient chaud, humide et fermé pour éviter que le collagène enrobé ne s’évapore dans le canal.
Au bout d’une heure, rincez l’appareil avec du PBS dans le sens opposé du revêtement pour rincer la solution de collagène. Pour commencer, incubez du sang total citraté avec un anticorps CD41 conjugué à la fluorescence, à l’aide d’un fluorophore de votre choix. Tachez le sang pendant 30 minutes sur une bascule à nutation.
Ensuite, allumez le microscope et les logiciels associés. Réglez le niveau du pousse-seringue de prélèvement avec la platine du microscope et ajustez les paramètres du pousse-seringue en fonction des exigences expérimentales. Ensuite, placez le dispositif microfluidique sur la platine du microscope et collez ses bords à la platine pour éviter tout mouvement.
Maintenant, connectez le tube d’un seizième de pouce de diamètre interne à un connecteur coudé, puis à une seringue de 10 millilitres avec un connecteur d’un seizième de pouce de diamètre interne. Remplissez la seringue de 10 millilitres de PBS stérile et connectez-la à la pompe à seringue. Ensuite, insérez le connecteur coudé dans la sortie du dispositif microfluidique.
Préparez des conduites d’entrée d’environ 10 centimètres de long avec un connecteur coudé à une extrémité et une coupe inclinée à l’autre extrémité. Maintenant, connectez le connecteur coudé d’entrée à l’entrée de l’appareil et positionnez la conduite d’entrée dans un tube de microcentrifugation à déchets placé sur un support coudé. Utilisez l’objectif 10 fois pour faire la mise au point sur les bords des canaux du dispositif microfluidique.
Ensuite, amorcez les lignes avec PBS. Avancez manuellement le pousse-seringue pour dégager le canal de tout PDMS ou débris. Vérifiez qu’il n’y a pas d’obstruction près de l’entrée et de la sortie du canal.
Maintenant, ouvrez les paramètres de capture d’image enregistrés ou créez une nouvelle procédure de capture d’image pour les images de série chronologique capturées toutes les une à deux secondes avec un canal en fond clair et des canaux fluorescents correspondant aux anticorps CD41 dans l’échantillon de sang. Obtenez l’échantillon de sang citrated filtré et mélangez-le en le pipetant de haut en bas juste avant de commencer l’expérience. Placez l’échantillon sur le support de microcentrifugeuse coudé.
Ensuite, positionnez la ligne d’entrée dans l’échantillon de sang et commencez à enregistrer la capture d’image. Retirez lentement la seringue pour remplir le volume mort dans la tubulure. Une fois que le sang atteint le canal, appuyez immédiatement sur Play sur le pousse-seringue pour reprendre l’écoulement au rythme souhaité.
Exécutez l’expérience jusqu’à ce que les plaquettes aient complètement occlus la région sténosée du dispositif microfluidique, ou jusqu’au point final de l’expérience, qui est généralement de 10 minutes. Une fois l’expérience terminée, arrêtez la capture d’image et arrêtez le pousse-seringue. Enfin, enregistrez la capture d’image dans le stockage approprié.
