Staphylococcus aureus est une bactérie gram-positive qui produit un large éventail de facteurs de virulence qui favorisent la pathogénie. Il s’agit notamment de leucotoxines bi-composants qui perturbent l’intégrité de la membrane des leucocytes polymorphonucléaires, également appelés PMN ou neutrophiles. Cette vidéo illustre l’isolement des PMN du sang entier humain et deux analyses distinctes pour quantifier la cytotoxicité de S.aureus contre ces cellules immunitaires innées importantes.
Ces essais peuvent tous être accomplis avec l’équipement standard de laboratoire et sont facilement adaptables pour examiner d’autres aspects de l’interaction d’agent pathogène d’hôte. Ces expériences utiliseront du sang entier prélevé sur des donneurs humains et nécessiteront l’approbation du comité institutionnel ou du comité d’examen approprié, ainsi qu’une déclaration selon que tous les participants ont obtenu un consentement éclairé. La première étape de cette procédure est l’isolement des neutrophiles par l’utilisation de gradients de centrifugation et de densité.
Tout d’abord, apportez 50 millilitres de chlorure de sodium de 3 % dextran 0,9 %, 35 millilitres de chlorure de sodium à 0,9 %, 20 millilitres de chlorure de sodium à 1,8 %, 12 millilitres de 1,077 gramme par solution de ficoll millilitre et 20 millilitres d’eau à température ambiante. Transférer 25 millilitres de sang humain entier héparinisé fraîchement dessiné dans deux tubes de centrifugeuse conique. Combinez 25 millilitres de sang entier héparinisé fraîchement dessiné avec 25 millilitres volume équivalent de température ambiante, 3% dextran, chlorure de sodium de 0,9% dans un rapport un à un.
Mélanger en berçant doucement chaque tube conique de 50 millilitres, puis laisser reposer à température ambiante pendant 30 minutes. Après incubation à température ambiante, deux couches distinctes apparaîtront. Transférer la couche supérieure de chaque mélange sanguin dextran dans de nouveaux tubes coniques de 50 millilitres.
Centrifugeuse à 450 g pendant 10 minutes à température ambiante avec des pauses faibles ou sans pauses. Aspirez soigneusement les deux supernatants et jetez sans déranger les granulés cellulaires. Resuspendez doucement chaque granulé cellulaire en deux millilitres de chlorure de sodium de 0,9 %.
Mélanger les granulés résuspendus en un seul conique de 50 millilitres, puis ajouter le chlorure de sodium restant de 0,9 % à un volume final de 35 millilitres. Sous-couche soigneusement 10 millilitres de 1.077 grammes par solution de ficoll millilitre sous la suspension de cellules utilisant une pipette de main. Après avoir tourné à 450 g pendant 30 minutes à température ambiante, avec des pauses faibles ou non, aspirez doucement le surnatant sans déranger la pastille cellulaire, comme indiqué précédemment.
Lyse les globules rouges en réutilisant la pastille cellulaire dans 20 millilitres d’eau à température ambiante. Mélanger délicatement en berçant pendant 30 secondes. Ajouter immédiatement 20 millilitres d’échantillon de chlorure de sodium et de centrifugeuse de 1,8 % à 450 g pendant 10 minutes à température ambiante.
Aspirez soigneusement le surnatant comme indiqué auparavant. Resuspendez doucement la pastille cellulaire en RPMI à température ambiante de deux millilitres et placez-la sur la glace. Comptez les cellules à l’aide d’un hémacytomètre.
Resuspendez les PMN purifiés à une concentration d’une fois 10 à la 7ème cellule par millilitre avec rpmi froid de glace et maintenez sur la glace. Combinez 100 microlitres de PMNs purifiés avec 300 microlitres de DPBS, contenant un microlitre de tache d’iodure de propidium dans deux tubes de cytométrie d’écoulement de répétition. Pour un contrôle positif, ajouter 40 microlitres de 0,5%Triton X-100 solution dans l’un des tubes de cytométrie d’écoulement et mélanger complètement.
Utilisez la cytométrie d’écoulement pour mesurer la dispersion vers l’avant, la dispersion latérale et la coloration de l’iodure de propidium pour déterminer la pureté et l’intégrité des PMN isolés. Seules les préparations PMN supérieures à 98% pures et supérieures à 95% de propidium iodode négatif doivent être utilisées. Pour le protocole décrivant l’isolement du sérum humain normal, se référer au manuscrit complet.
Préparer une plaque de 96 puits pour les analyses de cytotoxicité PMN en ajoutant 100 microlitres de sérum humain isolé de 20% dilués avec DPBS à des puits individuels qui seront utilisés dans ce test. Assurez-vous d’inclure au moins un puits de contrôle négatif qui ne recevra que des médias et au moins un puits de contrôle positif qui recevra 0,05%Triton X.Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après l’incubation, laver les puits codés deux fois avec 100 microlitres de DPBS glacé et placer la plaque sur la glace.
Retirez tout DPBS résiduel des puits de plaque et ajoutez doucement 100 microlitres de PMNs humains purifiés à une fois 10 aux 7èmes cellules par millilitre à chaque puits codé. Laissez les neutrophiles plaqués se déposer en les laissant sur la glace pendant au moins cinq minutes avant de les utiliser dans les analyses de cytotoxicité suivantes. Cette section décrit un essai qui quantifie la cytotoxicité des protéines extracellulaires produites par l’aureus de staphylocoque contre les PMN humains.
Culture S.aureus nuit dans les médias appropriés à l’aide d’un incubateur secouant fixé à 37 degrés Celsius la veille de l’expérience. Sous-culture S.aureus en effectuant une dilution d’une à 100 cultures de bactéries du jour au lendemain avec des médias frais. Incuber à 37 degrés Celsius en secouant jusqu’à ce que les bactéries atteignent la phase de croissance stationnaire précoce.
Après cinq heures de croissance, transférer un millilitre de sous-culture S.aureus dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et une centrifugeuse à 5000 g pendant cinq minutes à température ambiante. Après centrifugation, aspirer les supernatants. Passer les supernatants aspirés à travers un filtre à seringues de 0,22 micron dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et placer sur la glace.
Effectuer des dilutions en série de supernatants avec des supports glacés utilisés pour la culture staph aureus. Ajouter délicatement des échantillons de supernatants ou des supports prêtés pour des contrôles négatifs et positifs aux puits individuels d’une plaque de 96 puits contenant des PMN sur glace, comme décrit précédemment. Plaque de roche doucement pour distribuer les supernatants dans les puits et incuber à 37 degrés Celsius.
Aux heures désirées, retirer la plaque de l’incubateur et la placer sur la glace. Ajouter 300 microlitres de DPBS glacé contenant un microlitre d’iodure de propidium à chaque tube de cytométrie d’écoulement. Transférer les échantillons dans des tubes de cytométrie sur la glace.
Pour bien contrôler positif, ajouter 20 microlitres de 10% Triton X à l’échantillon avant de passer à un tube de cytométrie d’écoulement. Analyser la coloration du propidium iodure des PMN intoxiqués à l’aide de la cytométrie d’écoulement. Cette section décrit un essai qui quantifie la cytotoxicité de S.aureus suivant la phagocytose par pmns humains.
Les courbes de croissance définies par la densité optique à 600 nanomètres et la concentration de bactéries doivent être déterminées pour les souches pertinentes de Staph aureus avant d’être utilisées dans cet essai. Commencez les cultures du jour au lendemain des souches de S.aureus et des bactéries de sous-culture, comme décrit précédemment. Une fois sous-cultivé Staph aureus a atteint la croissance mi-exponentielle, transférer un millilitre de bactéries de culture à 1,5 millilitre tube de microcentrifugeuse et centrifugeuse à 5000 g pendant cinq minutes à température ambiante.
Laver S.aureus en aspirant son supernatant sans déranger la pastille et résuspendre les bactéries granulées à un millilitre DPBS. Vortex les échantillons pendant 30 secondes. Centrifuger les échantillons à 5000 g pendant cinq minutes à température ambiante.
Pour oxyder Staph aureus, résusez d’abord la pastille bactérienne en un millilitre de sérum 20% humain. Puis incuber des échantillons à 37 degrés Celsius avec agitation pendant 15 minutes. Laver l’aureus oxénolisé de Staphylocoque après centrifugation comme indiqué précédemment.
Diluer les souches oxénosées de Staphylocoque à une fois 10 à la 8e unité de formation de colonies, les UF par millilitre, avec un RPMI glacé. Vortex l’échantillon pendant 30 secondes et placer sur la glace. Confirmez les concentrations de Staphylocoque aureus utilisées pour ces analyses en placage d’une à 10 dilutions périodiques de bactéries sur l’agar.
Ajouter délicatement 100 microlitres par puits de chaque souche staph aureus, ou RPMI pour les contrôles positifs et négatifs, aux PMN dans une plaque de 96 puits sur glace à partir de l’étape 1.14. Plaque de roche doucement pour distribuer Staph aureus dans les puits. Synchroniser la phagocytose par plaque centrifugeuse à 500 g pendant huit minutes à quatre degrés Celsius et incuber la plaque à 37 degrés Celsius immédiatement après la centrifugation comme temps zéro.
Aux points de temps désirés, mettez la plaque sur la glace et ajoutez 200 microlitres de DPBS glacé contenant un iodure de propidium de microlitre à chaque tube de cytométrie d’écoulement puis transférez des échantillons à leur tube correspondant. Analyser les échantillons pour la coloration de l’iodure propidium à l’aide de la cytométrie du débit tel que décrit dans 2,8 et 2,9. La transcription des leucotoxines bi-composants qui ciblent les PMN humains par Staph aureus exige que le système de composant sa ou S2 démontre l’utilité des analyses décrites pour quantifier la cytotoxicité d’aureus de Staaph contre les PMNs humains.
Ces expériences ont été réalisées avec un isolat staph aureus cliniquement pertinent identifié comme USA300 chez un mutant isologénique de suppression de SA ou S dans cette souche. Le panneau gauche représente les PMN purifiés et le panneau droit représente des échantillons intentionnellement contaminés à titre d’exemple. Les PMN isolés à l’aide des procédures décrites dans la première section de ce protocole ont été tachés d’iodure de propidium et examinés à l’aide de cytométrie de débit.
Des parcelles de dispersion vers l’avant et latérales ont été utilisées pour détecter la contamination des PMNs purifiés par les monocytes ou les lymphocytes pendant les années 1A et 1B. L’intégrité du PMN a été déterminée à l’aide de la coloration de l’iodure du propidium. En utilisant la méthode décrite de purification du PMN humain, nous pouvons constamment isoler cinq fois 10 à la 7ème à une fois 10 au 8ème PMNs qui sont plus de 98% purs et sont plus de 95% propidium iodure négatif.
La cytotoxicité des protéines extracellulaires produites par USA300 et le mutant AsaeR/S a été testée contre les PMN purifiés. Ces expériences démontrent une augmentation dépendante de la concentration dans la coloration d’iodure de propidium des PMNs purifiés après 30 minutes d’intoxication avec des protéines extracellulaires produites par USA300, mais pas avec le mutant AsaeR/S. D’autres expériences ont démontré une augmentation constante de la proportion de PMNs positifs d’iodure de propidium suivant l’intoxication par usa300 protéines extracellulaires qui ont plafonné après approximativement 30 minutes.
La coloration minimale d’iodure de propidium des PMNs humains a été notée à tous les points de temps suivant l’exposition aux protéines extracellulaires produites par le mutant d’AsaeR/S. Enfin, la cytotoxicité des mutants USA300 et AsaeR/S contre les PMN à la suite d’une phagocytose synchronisée a été testée, une augmentation dépendante de la concentration de la proportion de PMNs positifs à l’iodure propidium a été observée 90 minutes après la phagocytose d’USA300. Significativement moins de PMNs étaient propidium iodide positif suivant la phagocytose du mutant d’AsaeR/S.
L’énumération de l’inoculum mutant USA300 et AsaeR/S a été utilisée dans chacune de ces expériences a démontré que le contraste dans la cytotoxicité entre ces souches n’était pas dû à des différences dans la concentration des bactéries utilisées. Ce protocole décrit les purifications des PMNs du sang humain dans deux techniques distinctes pour quantifier la cytotoxicité de S.aureus contre ces cellules immunitaires innées. Le succès de ces procédures dépendra de la qualité des PMN purifiés et de la préparation appropriée des bactéries ou des supernatants staph aureus.
Veuillez consulter le manuscrit complet pour obtenir des points importants à prendre en considération lors de l’exécution de ces procédures. USA300 est un isolat virulent de SARM et la perte d’AsaeR/S réduit considérablement la transcription des facteurs de virulence qui ciblent les PMN humains, faisant de ces souches des modèles idéaux pour comparer la cytotoxicité à l’aide des analyses décrites. Il peut être nécessaire d’adapter les conditions de croissance, les volumes de supernatants ajoutés ou le rapport des bactéries aux PMN lors de l’utilisation d’autres souches de Staphylocoque.
