Le test de protection enzymatique permet d’étudier l’étendue de l’internalisation du staphylocoque doré et sa capacité à survivre à l’intérieur des cellules adhérentes, ainsi que l’efficacité du composé antimicrobien. Le test de protection enzymatique amélioré simplifie considérablement la manipulation technique et permet de récupérer les bactéries internalisées des cellules faiblement adhérentes et des cellules en suspension. Josselin Rigaill, médecin et doctorant de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.
Deux jours avant le test d’infection, ensemencez des cellules épithéliales A549 à une densité de 2,0 fois 10 à la cinquième cellule par millilitre par puits d’une plaque de 24 puits et incubez les cellules pendant 48 heures à 36 degrés Celsius dans du dioxyde de carbone à 5%, jusqu’à ce qu’elles atteignent 100% de confluence. Le jour de l’essai, retirez et jetez le milieu de culture usé des trois puits dédiés au comptage des cellules A549 et ajoutez un millilitre de milieu infectieux complet contenant cinq microgrammes par millilitre de Hoechst 33342 et un microgramme par millilitre d’iodure de propidium. Incuber les cellules pendant 30 minutes, puis, à l’aide d’un microscope à fluorescence à grand champ, compter le nombre de cellules et calculer la viabilité cellulaire.
Pour préparer la suspension bactérienne, distribuer 25 millilitres de milieu infectieux complet dans un tube et préchauffer à 36 degrés Celsius. Ensuite, ajustez la suspension de Staphylococcus aureus à une DO de 0,5 dans un milieu infectieux complet à l’aide d’un densimètre cellulaire, puis préparez 20 millilitres de suspension bactérienne pour l’inoculation cellulaire en diluant la culture dans un milieu infectieux complet pour obtenir un MOI d’un en fonction du nombre de cellules par puits. Ensuite, à l’aide d’un plaqueur en spirale automatique, déterminez la charge de Staphylococcus aureus de la suspension bactérienne diluée à utiliser pour l’étape d’inoculation cellulaire et incubez les plaques de gélose pendant 18 à 24 heures à 36 degrés Celsius.
Le lendemain, comptez le nombre de colonies avec un compteur de colonies pour calculer le MOI précis pour chaque souche testée. Avant l’inoculation cellulaire, observez chaque puits de la plaque de 24 puits par microscopie à faible grossissement pour vous assurer que les cellules sont en bonne santé et se développent comme prévu, puis retirez et jetez le milieu de culture cellulaire usé de la plaque de 24 puits et ajoutez 500 microlitres de la suspension bactérienne à chaque puits contenant des cellules confluentes à 100%. Incuber les cellules pendant deux heures à 36 degrés Celsius dans 5% de dioxyde de carbone.
Pour quantifier les bactéries intracellulaires avec le test de protection enzymatique amélioré, préparez 4x tampon de lyse, 2% Triton X-100, trypsine-EDTA et lysostaphine stock dans les solutions de travail comme mentionné dans le manuscrit du texte. Ensuite, préparez 6,25 millilitres de milieu infectieux complet complété par de la lysostaphine en ajoutant six millilitres de milieu infectieux complet à 250 microlitres de la solution de travail de lysostaphine. Ensuite, ajoutez 250 microlitres du milieu d’infection complet complété par de la lysostaphine dans chaque puits et agitez doucement la plaque en faisant pivoter la plaque à la main.
Pour permettre à la lysostaphine de tuer les bactéries extracellulaires, incuber les cellules pendant une heure à 36 degrés Celsius dans 5% de dioxyde de carbone, puis inactiver la lysostaphine en ajoutant 10 microlitres de protéinase K à 20 microgrammes par millilitre dans chaque puits et en incubant les cellules pendant deux minutes à température ambiante. Ensuite, ajoutez 250 microlitres de tampon de lyse 4x pour lyser les cellules par choc osmotique et incuber les cellules pendant 10 minutes à 36 degrés Celsius. Après l’incubation, pipettez la cellule lysée de haut en bas plusieurs fois pour s’assurer que les cellules sont complètement lysées et homogénéisées, puis utilisez un plaqueur à spirale automatique pour déterminer la charge de Staphylococcus aureus de chaque puits et incuber les plaques de gélose pendant 18 à 24 heures à 36 degrés Celsius.
Le lendemain, comptez le nombre de colonies avec un compteur de colonies pour calculer la charge intracellulaire de Staphylococcus aureus de chaque puits. L’internalisation de deux souches de Staphylococcus aureus par les cellules épithéliales A549 est représentée ici. En utilisant le test de protection enzymatique qui comprend des lavages pour éliminer la lysostaphine, les charges intracellulaires moyennes étaient de 4,46 et 0,49 log ufc par millilitre pour le type sauvage SF8300 et le mutant isogénique dépourvu des gènes fnbA et B, respectivement.
En utilisant le test de protection enzymatique amélioré qui utilise la protéinase K pour inactiver la lysostaphine, les charges étaient respectivement de 4,53 et 0,56 log ufc par millilitre. L’activité intracellulaire de la vancomycine, de la rifampicine et de la lévofloxacine contre Staphylococcus aureus mesurée à l’aide d’un test de protection enzymatique est décrite ici. Les charges intracellulaires moyennes étaient de 4,57 log ufc par millilitre pour le contrôle, de 4,51 pour la vancomycine, de 3,03 pour la rifampicine et de 2,91 pour la lévofloxacine.
Les lavages intensifs pour éliminer l’enzyme ont tendance à détacher les cellules les plus infectées, ce qui peut donner des résultats inexacts et soutenir l’utilisation du protocole amélioré. Le test de protection enzymatique amélioré facilite l’étude de l’internalisation du staphylocoque doré avec organoïde et peut être facilement adapté sur le système de dépistage à haute teneur utilisé en mettant
