Ces protocoles sont conçus pour comprendre comment les neutrophiles humains interagissent avec les biofilms bactériens et les tuent. L’objectif est de mieux comprendre cela et de limiter la variabilité d’un essai à l’autre, en comprenant qu’il existe des problèmes inhérents aux neutrophiles humains d’un donneur à l’autre. Les techniques énumérées ici ont été optimisées pour permettre aux utilisateurs d’effectuer des expériences avec une variabilité minimale, en particulier avec des biofilms faiblement attachés.
De plus, ces protocoles peuvent également être adaptés pour étudier d’autres microbes pouvant former des biofilms. Commencez par obtenir des colonies isolées de Staphylococcus aureus à partir d’un stock cryoconservé en utilisant une technique de plaque de stries sur une plaque de gélose riche en nutriments, comme la gélose tryptique au soja. Enduisez les puits individuels d’une plaque de 96 puits avec 100 microlitres de LPL dilués dans de l’eau stérile et incuber à température ambiante pendant 30 minutes.
Aspirer la solution PLL de manière aseptique à l’aide d’un piège d’aspiration assisté par le vide. Laissez les puits sécher pendant la nuit à température ambiante. Préparer une culture de nuit en inoculant une colonie de S. aureus dans du MEM-alpha supplémenté en glucose à 2% et incubé à 37 degrés Celsius pendant 16 à 18 heures à 200 rotations par minute.
Diluer la culture de nuit en transférant 50 microlitres à cinq millilitres de MEM-alpha frais supplémenté en glucose à 2%. Ensuite, incuber à 37 degrés Celsius à 200 rotations par minute jusqu’à ce que la phase logarithmique moyenne soit atteinte. Utilisez MEM-alpha pour normaliser la culture logarithmique moyenne à une DO de 0,1.
Transférer 150 microlitres de culture normalisée dans chaque puits de la plaque de 96 puits traitée PLL. Incuber la plaque dans une chambre humidifiée à 37 degrés Celsius pendant 18 à 20 heures. Aspirer le surnageant pour éliminer les cellules planctoniques.
Lavez délicatement la biomasse restante avec 150 microlitres d’HBSS pour éliminer les cellules non attachées. Répétez au moins deux fois pour enlever toutes les cellules planctoniques. Ajouter 100 microlitres de sérum humain normal à 20% dilué dans HBSS goutte à goutte au biofilm lavé et incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes pour opsoniser le biofilm.
Aspirer la solution de sérum et laver les biofilms goutte à goutte avec 150 microlitres de HBSS. Aspirer le HBSS, laissant derrière lui des puits avec des biofilms opsonisés. Ajouter du luminol aux neutrophiles remis en suspension dans le HBSS pour obtenir une concentration finale de cinq micromolaires luminol.
Cette solution est prête à l’emploi pour les groupes A et C.Ajouter des neutrophiles mélangés avec du luminol aux puits avec des biofilms opsonisés. Pour le groupe D, préparer 50 micromolaires solution de luminol dans HBSS dans un tube séparé sans aucun neutrophile, et l’ajouter au puits contenant le biofilm. Aliquote 350 microlitres de neutrophiles mélangés avec du luminol et ajouter PMA à une concentration finale de 500 nanogrammes par millilitre au mélange.
Pour le groupe B, ajouter les neutrophiles de ce mélange dans des puits sans biofilm. Cela sert de contrôle positif. Centrifuger la plaque à 270 RCF pendant 30 secondes à quatre degrés Celsius.
Assurez-vous que le lecteur de plaques est réglé à 37 degrés Celsius, la luminescence et la lecture cinétique pendant 60 minutes à intervalles de trois minutes. Placez la plaque dans le lecteur de plaques pour mesurer la production de ROS par les neutrophiles pendant 60 minutes. Utilisez une souche fluorescente de S. aureus, telle que USA300, exprimant la GFP pour faciliter l’imagerie microscopique.
Incuber les neutrophiles avec 100 micromolaires BCD pendant 30 minutes dans une bascule à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone atmosphérique. Assurez-vous que les échantillons sont incubés dans l’obscurité et limitez l’exposition à la lumière. Pour laver l’excès de BCD, centrifuger les neutrophiles à 270 RCF pendant cinq minutes et aspirer le surnageant.
Re-suspendre les neutrophiles dans du HBSS frais. Ajoutez ensuite de l’homodimère-1 d’éthidium aux neutrophiles colorés par BCD à une concentration finale de quatre micromolaires pour surveiller la mort des neutrophiles et des bactéries. Lavez le biofilm avec HBSS et ajoutez 150 microlitres de neutrophiles au biofilm de S. aureus qui a été cultivé en microlames.
Incuber les microlames dans une chambre humidifiée pendant 30 minutes. Le nombre de cellules bactériennes sera basé sur le nombre de cellules obtenues à partir du placage de biofilm de 18 heures. Imagez l’interaction du biofilm des neutrophiles à l’aide de canaux fluorescents correspondant aux colorants fluorescents, ou aux longueurs d’onde d’excitation et d’émission des protéines.
Les milieux de croissance bactériens ont minimisé la viabilité des neutrophiles à environ 60 % après 30 minutes de période d’incubation. Cependant, les milieux de culture de cellules de mammifères n’ont pas affecté la viabilité des neutrophiles et peuvent également favoriser la croissance des biofilms de S. aureus. Les neutrophiles traités avec la PMA utilisée comme témoin ont montré une augmentation de la production de ROS.
En l’absence de biofilms, les neutrophiles traités avec du PMA ont montré une production robuste de ROS. En présence de biofilm de S. aureus, la production globale de ROS par les neutrophiles traités avec PMA a diminué, tandis qu’en l’absence de PMA, les neutrophiles dépendaient uniquement de leur interaction avec le biofilm, réduisant encore la production de ROS. La microscopie fluorescente à grand champ a révélé que de nombreux neutrophiles étaient localisés à la surface tandis que quelques-uns se trouvaient dans les biofilms de S. aureus.
La plupart des cellules de S. aureus interagissant avec les neutrophiles étaient mortes, tandis que quelques-unes sont restées vivantes comme déterminé par la coloration VIVANT / MORT. Les biofilms colorés à l’homodimère-1 d’Ethidium ont révélé une fraction de la population morte de S. aureus dans le biofilm. L’effet du lavage du biofilm et des neutrophiles après 30 minutes d’incubation pour éliminer les neutrophiles non adhérents a révélé qu’environ 33% des neutrophiles morts étaient encore attachés au biofilm.
Les protocoles énumérés ici peuvent également être utilisés pour étudier plus avant d’autres fonctionnalités des neutrophiles, telles que la phagocytose et la formation de pièges extracellulaires à neutrophiles lorsque les neutrophiles rencontrent des biofilms.
