Ce protocole quantifie la métastase pulmonaire, qui est une cause agressive et commune de décès lié au cancer du sein, avec une précision et une efficacité accrues dans un modèle préclinique de cancer du sein. Par rapport à la technique originale, ce protocole donne aux chercheurs des résultats plus rapides et plus cohérents. Il atténue les erreurs de comptage humain grâce à une technologie informatique facile à utiliser.
Cette technique peut absolument être étendue à la recherche préclinique étudiant les effets des thérapies de cancer du sein sur la métastase de poumon en permettant aux chercheurs de démontrer le fardeau métastatique diminué suivant le traitement réussi. Commencez par étiqueter un tube conique de 15 millilitres pour l’échantillon de tissu. Ajouter ensuite 2,5 millilitres de type quatre mélange de collagène et 30 unités d’élaslasase au tube.
Déplacez le poumon vers un puits 1X HBSS propre et faites-le tourbillonner avec des forceps pour enlever tout sang restant, puis transférez-le à une plaque vide de culture tissulaire de 3,5 centimètres. Hacher le poumon avec des ciseaux, puis rincer l’assiette avec 2,5 millilitres de HBSS et transférer le HBSS avec les morceaux de poumon dans un tube conique préparé de 15 millilitres avec le cocktail de collagène et d’élasstase. Incuber le tube pendant 75 minutes à quatre degrés Celsius sur un rocker ou une roue rotative.
Pendant ce temps, étiquetez un tube de centrifugeuse de 50 millilitres et une plaque de culture tissulaire de 10 centimètres pour chaque souris. Si vous faites une dilution, étiquetez suffisamment de plaques de culture tissulaire pour les dilutions. Amener le volume du tube jusqu’à 10 millilitres avec 1X HBSS, puis verser le contenu sur une passoire cellulaire de 70 micromètres dans le tube conique de 50 millilitres.
Utilisez le piston d’une seringue d’un millilitre pour moudre doucement l’échantillon à travers la passoire. Centrifuger le tube pendant cinq minutes à 350 fois G et jeter le supernatant, puis laver la pastille deux fois avec 10 millilitres de 1X HBSS. Resuspendez la pastille en 10 millilitres de 60 micromolaires 6-thioguanine médias de culture complète, et plaquez les échantillons dans les plaques de culture cellulaire de 10 centimètres en utilisant un schéma de dilution si désiré.
Incuber les plaques à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant cinq jours. Verser les supports de culture des plaques dans le conteneur à déchets approprié. Pour fixer les cellules, ajouter cinq millilitres de méthanol non dilué à chaque plaque et incuber pendant cinq minutes à température ambiante, en s’assurant de tourbillonner le méthanol afin qu’il couvre toute la plaque.
Verser le méthanol des assiettes dans le contenant de déchets approprié, puis rincer chaque assiette avec cinq millilitres d’eau distillée. Ajoutez cinq millilitres de bleu méthylène à 0,03 % par plaque et incubez-le pendant cinq minutes à température ambiante, en vous assurant de faire tourbillonner la solution bleu méthylène de sorte qu’elle couvre toute la plaque. Verser le bleu méthylène dans le contenant de déchets approprié et rincer chaque assiette à nouveau avec cinq millilitres d’eau distillée.
Retournez la plaque à l’envers et épongez-la contre une serviette en papier pour enlever l’excès de liquide. Placez la plaque sur son couvercle et laissez-la sécher à l’air libre pendant la nuit. Les colonies métastatiques seront bleues.
Une fois les plaques séchées, elles peuvent être conservées indéfiniment à température ambiante. Retirez les couvercles étiquetés des plaques, en prenant soin d’assurer une identification claire des échantillons. Alignez toutes les plaques pulmonaires tachées sur une surface propre et légère.
Prenez une photo de la collection de plaques dans un endroit bien éclairé, en vous assurant de minimiser les reflets. Les réflexions dans les plaques influenceront l’analyse d’image et devraient être évitées. Portez une attention particulière aux photos prises et prenez plusieurs photos sous plusieurs angles.
Après avoir photographié les plaques, recadrer l’image pour exclure les couvercles ou quoi que ce soit en arrière-plan. Ouvrez l’image dans Fiji ImageJ et changez-la en noir et blanc en cliquant sur l’image, ajustez et colorez le seuil. Sélectionnez ensuite par défaut pour la méthode de seuil, noir et blanc pour la couleur de seuil, et laboratoire pour l’espace de couleur.
Assurez-vous que la boîte de fond sombre n’est pas sélectionnée. L’image doit maintenant être en noir et blanc. Le noir représente le fond clair, et le blanc représente les colonies métastatiques bleues.
Utilisez l’outil cercle pour sélectionner la zone à analyser. Dessinez un cercle à utiliser pour toutes les plaques pour vous assurer que chaque plaque est analysée pour la même zone de taille. Choisissez une taille qui maximise la zone analysée sur les plaques tout en minimisant le bruit de fond qui apparaît sur le bord des plaques.
La taille apparaît dans la barre d’outils au fur et à mesure qu’elle est dessinée. Analyser le cercle sélectionné pour déterminer le pourcentage de zone blanche. Cliquez sur analyser et analyser les particules, puis sélectionnez zéro à l’infini pour la taille, zéro à un pour la circularité, et rien pour le spectacle.
Cochez la case résumée et frappez bien. Déplacez le cercle vers la plaque suivante dans l’image en l’saisissant au centre et répétez l’analyse. Copiez et coller le résultat dans une feuille de calcul.
La zone en pourcentage, qui est le pourcentage de la zone sélectionnée qui est blanche, représente le fardeau métastatique. Une fois que toutes les plaques et images ont été analysées, la moyenne des résultats de la zone pour cent entre les différentes images pour chaque plaque pour atténuer les incohérences entre les images. Fidji ImageJ analyse a été comparée au comptage manuel et l’analyse histopathologique.
Lorsque trois chercheurs distincts ont compté manuellement les colonies métastatiques, les résultats étaient incohérents entre les compteurs. Les résultats de Fiji ImageJ étaient cohérents entre les compteurs pour chacune des trois images. Les résultats des trois images et des trois compteurs ont été combinés pour chaque plaque pulmonaire.
Les résultats ont été en moyenne pour chaque plaque pour tenir compte des variations entre les images, ce qui a fourni des résultats cohérents entre les compteurs. Lors du classement des plaques de la plupart à la moins métastatique, le comptage manuel s’est mis d’accord sur la plaque la plus confluente, mais tous les rangs suivants étaient incohérents. Les rangs des résultats moyens de Fiji ImageJ étaient beaucoup plus cohérents entre les compteurs.
Pour démontrer l’importance d’éviter les réflexions dans les images, une image avec le reflet d’une main et son analyse ultérieure fiji ImageJ est montré avec une image de la même plaque sans réflexion. Les imperfections foncées d’une surface de fond sale ou d’un résidu d’échantillon de sang sur les plaques peuvent également avoir un impact négatif sur l’analyse d’ImageJ fidjienne. Cette plaque sanguine n’a que deux colonies métastatiques, mais le résidu sombre a amené Fiji ImageJ à la considérer comme métastatique à 31,6 %.
Lorsque vous essayez ce protocole, n’oubliez pas d’examiner attentivement les images pour la réflexion, utilisez le même cercle de taille pour chaque plaque de l’image, et la moyenne des résultats pour chaque plaque entre au moins trois images distinctes.
