Notre protocole permet l’isolement et la séparation des KRAS correctement traités à haut rendement. La production de KRAS authentiquement farnesylated et carboxyméthylated permet d’effectuer des expériences qui ont KRAS dans leur membrane tout comme dans les cellules mammifères. Le rendement élevé du protocole le distingue des travaux antérieurs.
Nous purifions généralement trois à cinq milligrammes de protéines par litre de matériau d’expression. Cela nous permet de mener une variété d’expériences biophysiques et de biologie structurale. Kras est muté dans 20% des cancers et 90% dans les cancers du pancréas.
Donc, avoir un protocole pour produire des protéines authentiquement traitées est très utile pour développer des écrans de médicaments afin que vous puissiez étudier la protéine réelle comme il serait sur la membrane des cellules cancéreuses. Ce protocole est également très utile pour étudier d’autres protéines qui sont farnylées et entièrement traitées dans les cellules. Et en tant que tel, tout ce que vous devez faire est d’échanger le KRAS avec la protéine d’intérêt et de le mettre dans le baculovirus.
Les étapes critiques sont celles autour de la chromatographie d’échange de cation. L’utilisation de la colonne appropriée et la limitation du temps de la protéine est dans le tampon de sel faible sont essentiels pour le succès. Comprendre que les précipitations ne sont pas un type d’événement globe de neige aide à guider ceux qui sont nouveaux dans le protocole.
Ceci est renforcé en montrant la nécessité de diviser la charge de colonne d’échange de cation en plusieurs charges plus petites. Après avoir lysé les cellules, clarifié le lysate et purifié la protéine cible par l’IMAC, analyser les fractions protéiques à l’aide de la page SDS et de la coloration Coomassie. Mettre en commun les fractions de pointe et dialyser la piscine pendant la nuit contre deux litres de tampon D à quatre degrés Celsius.
Le lendemain, retirez l’échantillon de la dialyse et centrifugez-le à 4000 fois g pendant 10 minutes pour enlever tout précipité. L’échantillon final dialysé et clarifié est souvent encore flou, mais peut être appliqué à la colonne CEX sans autre traitement. Préparez une colonne d’échange de cation de 20 millilitres en la lavant avec trois volumes de colonne de G tampon, puis avec trois volumes de colonne de tampon F.Next, diluez 20 millilitres de l’échantillon dialysé à une concentration finale de chlorure de sodium de 100 millimolaires en ajoutant 20 millilitres de tampon E et appliquez l’échantillon sur la colonne d’échange.
Il est essentiel de diluer la petite quantité de l’échantillon au lieu de tout à la fois et les échantillons dilués doivent être appliqués à la colonne immédiatement après la dilution pour limiter les précipitations de la protéine. Continuez à charger la colonne avec de l’échantillon fraîchement dilué à mesure que la dilution précédente approche de la fin de la charge. Lavez ensuite la colonne à l’absorption de base 280 avec le tampon F qui nécessite généralement trois volumes de colonnes.
Elute la protéine de la colonne avec un gradient de 400 millilitres de la zone tampon F à 65% tampon G, la collecte de l’élitiste en six fractions millilitres. Une fois le gradient terminé, continuer à laver la colonne pour un volume supplémentaire de 1,5 colonne de 65% tampon G.Choisissez les fractions positives basées à la fois sur la page SDS et coomassie blue analyse des taches ainsi que l’inspection de la trace UV du chromatogramme. Puis mettre en commun la protéine et la digérer avec la protéase His6 TEV selon les directives manuscrites.
Après digestion et dialyse, chargez la protéine sur une colonne IMAC de 20 millilitres équilibrée avec le tampon A à trois millilitres par minute. Recueillir sept fractions millilitres au cours de cette chromatographie et laver la colonne avec un total de trois volumes de colonne de tampon A ou jusqu’à ce que l’absorption de base soit atteinte. Elute la protéine cible avec un gradient de volume de cinq colonnes de C tampon de 0% à 10% et de recueillir sept fractions millilitres.
Identifiez ensuite les fractions positives avec la page SDS. Lorsqu’il est analysé avec la page SDS, le lysate clarifié doit contenir une bande sombre qui migre vers environ 65 kilodaltons qui correspond à la protéine de fusion His6-MBP-tev-KRAS4b. Le FNTAb co-exprimé migre vers 48 kilodaltons.
L’étape CEX dans la purification est essentielle parce qu’elle réduit l’étendue de la protéolyse et enrichit la protéine entièrement traitée, mais est la partie la plus compliquée du protocole. Un résultat typique de cette étape a un pic proéminent trois avec le KRAS4b-FMe, mais les profils d’élitution peuvent être variables. L’analyse de masse intacte à l’aide de l’ESIMS confirme la masse moléculaire précise des protéines et donc la proportion relative de farnesylation ou de carboxyméthylation.
Bien que les lots finaux typiques contenaient certains KRAS4b-FARN détectables, cette proportion était inférieure à 15 % en termes de hauteur maximale à partir de cette analyse. L’analyse de masse indigène a été utilisée pour déterminer la masse du KRAS4b lié au PIB. Le solvant d’échantillon a été échangé contre de l’acétate d’ammonium pour assurer une ionisation plus douce permettant au complexe indigène de rester intact.
L’interaction de KRAS4b-FMe et liposomes a été mesurée avec la résonance plasmon de surface pour valider la farnesylation et la carboxyméthylation sont nécessaires pour KRAS4b-FMe de se lier aux membranes. Comme prévu, KRAS4b-FMe lié aux liposomes tandis que KRAS4b non transformé n’a pas. Réduire au minimum le temps d’exposition de la protéine à un faible teneur en sel est l’aspect le plus critique du protocole qui affecte le rendement.
La protéine n’est que brièvement à cette faible concentration de sel après la dilution dans le tampon E.La protéine peut être utilisée pour une variété d’expériences biophysiques qui utilisent des mimétiques membranaires comme les liposomes ou les nanodiscs pour étudier quels lipides KRAS interagit avec. En utilisant ces données, nous pouvons commencer à extrapoler comment KRAS interagit avec la membrane plasmatique de la cellule. En utilisant kras-FMe purifié, nos collègues ont été en mesure de résoudre la structure cristalline aux rayons X de KRAS dans le complexe avec un chaperon qui est spécifique pour la forme farnétique et méthylé de cette protéine.
