L’insuffisance cardiaque est la principale cause de décès tant chez les hommes que chez les femmes dans le monde. De nouvelles preuves suggèrent l’altération du métabolisme cardiaque et systémique contribuent à la pathologie de l’insuffisance cardiaque. Identifier rapidement quels métabolites affectent le couplage excitation-contraction reste un défi.
L’approche traditionnelle d’isoler le myocyte cardiaque de la souris adulte est un processus long et stimulant. La méthode innovante de cet article rend un processus rigoureux plus efficace et plus facile à exécuter. En outre, à l’aide d’une sonde fluorescente, nous pouvons effectuer de nombreuses évaluations phénotypiques de la façon dont les produits chimiques peuvent induire une toxicité cardiaque ou un dysfonctionnement au niveau cellulaire.
En identifiant quelles molécules modifient la fonction myocyte, de nouvelles thérapeutiques peuvent être identifiées pour le traitement de l’insuffisance cardiaque. En utilisant des souris transgéniques, nous pouvons sonder différents gènes pour déterminer qui peut prévenir et contribuer à l’insuffisance cardiaque. Cette information sera essentielle dans le futur traitement de l’insuffisance cardiaque.
Matthew Klos et un étudiant Shreyas Suresh feront la démonstration de la procédure. Pour commencer, décongeler la solution de laminine de travail sur la glace. À l’aide d’une pipette P1000, aspirer 200 microlitres de laminine et faire glisser doucement la pointe de la pipette le long d’un bord du coverslip stérilisé pour permettre à l’action capillaire de retirer une minuscule quantité de laminine pour faciliter l’attachement à la plaque de six puits.
Puis expulser le reste de la laminine au centre de la couverture dans un mouvement circulaire. Étendre la gouttelette de laminine sur le coverslip. Placez les coverslips dans un incubateur de 37 degrés Celsius pendant au moins une heure et jusqu’à 24 heures avant l’isolement.
Pour isoler les myocytes d’un cœur préparé dans le KHB-HB froid, placez l’échantillon sous un microscope stéréo. Pour éviter les embolies, amorcer la canule aortique en la submersant dans la solution KHB-HB et en utilisant une seringue de 20 millilitres pour forcer la solution à travers. Assurez-vous que le cœur est submergé et que la canule est amorcée avant l’excision cardiaque.
Avec un 5 forceps, cannulate le coeur. Confirmer le bon positionnement de la canule en visualisant la pointe de la canule à environ un millimètre au-dessus de l’insertion aortique dans le ventricule. Puis commencer le flux de KHB-HB en tournant le robinet d’arrêt sur le Langendorf.
Connectez la canule au Langendorf pour parcourir le cœur pendant cinq minutes. Ensuite, faites pivoter le robinet d’arrêt pour passer de la perfusion du réservoir KHB-HB au réservoir tampon de digestion. Une fois que le tampon de digestion atteint le cœur, réglez une mise à jour.
Recueillir le perfusate dans un bécher stérile de 100 millilitres. Remplissez le réservoir tampon de digestion au besoin avec le perfusate jusqu’à ce que le temps de digestion ait expiré. Après la digestion, dans un bécher stérile de 100 millilitres, séparez les chambres du cœur avec des forceps et des ciseaux Iris.
Placez chaque chambre dans un puits séparé d’une assiette de six puits. Verser cinq millilitres de solution de collagène dans chaque puits. Utilisez immédiatement des ciseaux pour émincer le tissu cardiaque en morceaux d’environ un mètre cube.
À l’aide d’une pipette de transfert stérile, triturer délicatement le tissu cardiaque haché avec tampon de digestion. Une fois que les morceaux de tissu deviennent blancs et plumeux, placez la plaque sous un microscope inversé pour examiner les cellules. Si le nombre de cellules viables est supérieur à 80%, filtrez les cellules dans un tube conique de 50 millilitres à l’aide d’une passoire cellulaire de 100 microns.
Si le nombre de cellules viables est inférieur à 80%, vérifiez le temps qu’il a fallu pour cannuler. Si le temps de cannulation est de plus de cinq minutes, essayez un autre cœur. Si ce n’est pas le cas, analysez de nouvelles fentes de collagène dans le cadre du programme d’échantillonnage des collagènes.
Ensuite, pelleter les cellules en centrifugant à 215 fois g pendant deux minutes. La pastille doit être compacte et non lâche. Si la pastille est lâche, la préparation contient de nombreuses cellules mortes.
Dans une hotte de culture tissulaire, resuspendez la pastille compacte en 10 millilitres de tampon d’arrêt. Pelleter les cellules à nouveau en centrifugant à 215 fois g pendant deux minutes. Resuspendez les cellules en cinq millilitres de tampon de placage.
Effectuez un compte de cellules sur un compteur de cyto et ajustez le volume du tampon de placage pour atteindre une concentration finale de myocytes de deux fois 10 aux quatre cellules par millilitre. Maintenant, retirez les coverslips enduits de laminine de l’incubateur. Aspirer la gouttelette de laminine si elle est présente.
Plaque 200 microlitres de suspension myocyte sur chaque coverslip. Placez les coverslips dans un incubateur de 37 degrés Celsius avec 21% d’oxygène et 5% de dioxyde de carbone pendant deux heures pour permettre l’attachement. Après deux heures, sortez les coverslips et aspirez les cellules non attachées.
Ajouter deux millilitres de médias culturels et de culture dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant une période de quatre jours. Tout d’abord, retirez le composant A et le composant B du kit potentiel de la membrane. Dans un tube conique de 15 millilitres, combiner 50 microlitres du composant B et cinq microlitres du composant A pour former un mélange de colorant de tension.
Vortex à mélanger. Ajouter 10 millilitres de supports de placage au tube conique de 15 millilitres contenant le mélange de colorants de tension pour former le mélange de colorant potentiel de la membrane. Encore une fois, vortex à mélanger.
Retirez ensuite une plaque de myocytes de six puits de l’incubateur. Aspirez les médias. Ajouter 800 microlitres du mélange de colorant potentiel de la membrane à chaque puits.
Couvrir l’assiette de papier d’aluminium et laisser la plaque à température ambiante pendant 15 minutes. Après cela, aspirer le mélange de teinture des médias de chaque puits et ajouter un millilitre de la solution modifiée tyrode à chaque puits. Couvrir de papier d’aluminium.
Allumez l’équipement dans l’ordre du microscope, de la lampe d’arc, de l’HyperSwitch, du système d’interface de fluorescence, de l’alimentation de MyoCam, du stimulateur de champ, et de l’ordinateur. Assurez-vous que les ensembles de filtres d’émission d’excitation conviennent au colorant d’imagerie. Par exemple, fura-2 est excité à 340 nanomètres et 380 nanomètres de lumière.
Il émet à 510 nanomètres de lumière. Fluo-4 et le colorant membranaire de tension sont excités à 485 nanomètres de lumière et émettent à 520 nanomètres de lumière. Primez le système d’enregistrement en tournant le vide, en ouvrant complètement la pince du tuyau, et en plongeant doucement chaque seringue de 60 millilitres avec la solution de Tyrode dans le collecteur.
Pour les enregistrements de calcium, utilisez la solution tyrode standard. Pour les enregistrements de tension, utilisez la solution tyrode modifiée. Allumez le chauffe-eau en ligne.
Maintenez la température de sorte que le perfusate dans la chambre est à 36 plus ou moins un degré Celsius pendant au moins 15 minutes. Ensuite, ouvrez le logiciel d’acquisition. Assurez-vous que les paramètres sont définis pour le colorant d’imagerie correct.
Éteignez le stimulateur. Dans l’obscurité, retirer le papier d’aluminium de la plaque de six puits et placer un coverslip dans la chambre de stimulation. Placez la plaque au microscope et concentrez-vous sur les myocytes en utilisant l’objectif 10X.
Une fois au point, commencer à arpenter par champ stimulant à un hertz et 0,2 volts. Augmentez graduellement la tension jusqu’à ce qu’un rythme en un à un soit obtenu. Augmentez ensuite la tension jusqu’à 1,5 fois le seuil atteint.
Passez de l’objectif 10X à l’objectif 40X. Concentrez-vous sur une cellule qui suit un rythme en personne. Ajustez les nuances en plastique de sorte qu’une seule cellule est dans le champ de vision.
À l’aide du logiciel, placez la zone d’intérêt sur des sarcomeres bien définis. Démarrez le logiciel d’acquisition pour lancer la lumière d’excitation. À l’aide des filtres de densité neutre, ajustez le réglage de l’intensité en conséquence pour obtenir un rapport signal-bruit adéquat.
Ici, les traces représentatives de shortening de calcium et de sarcomere enregistrées à partir des myocytes de souris C57BL/6 utilisant le fura-2 sont montrées. Une quantification des données moyennes de l’ensemble obtenues à partir de souris C57BL/6 et de leurs compagnons de litière transgéniques ne montre aucune différence entre les groupes, sauf pour le temps de relaxation à 10 hertz arpentage. Le tracé de tension enregistré à partir d’un myocyte de souris C57BL/6 rythmait à 10 hertz a été post traité pour obtenir un signal utilisable.
Le potentiel d’action moyen de l’ensemble après une passe basse Butterworth ou un filtre numérique Savitzky-Golay a été appliqué montrent des différences subtiles dans la forme des potentiels d’action. Les traces enregistrées à partir de myocytes de rat rythme à un hertz montre en plus du signal de tension étant inférieur au signal de calcium, la cinétique de contraction sont différents ainsi. C’est parce que les dyes de calcium tamponnent le calcium tandis que les dyes de tension ne le font pas.
Comme avec le calcium transitoire, les myocytes ont démontré des changements dépendants de rythme dans leur durée potentielle d’action optique. La prolongation drogue-induite du potentiel d’action a été démontrée aussi bien. Les 11 dernières secondes d’un enregistrement de 20 secondes ont indiqué que l’exposition prolongée des myocytes à la lumière bleue mène à l’activité déclenchée.
Lorsque vous essayez cette procédure, la chose la plus importante à retenir est d’utiliser la lumière d’intensité la plus faible possible afin que vous n’endommagez pas les myocytes. Myocyte isolé en utilisant notre approche peut également être utilisé pour l’immunohistochimie ou effectué pour l’analyse des taches occidentales. La beauté de cette technique, il permet aux chercheurs d’évaluer rapidement comment la variété des molécules et des gènes aident le couplage excitation-contraction à l’aide d’un seul système.
