Le métabolite est influencé par des facteurs tels que l’environnement génomique et les pratiques de gestion. La compréhension des interactions entre ces facteurs pourrait permettre une prédiction et une gestion plus précises du rendement et de la qualité d’un produit. En incorporant une troisième phase mobile, plutôt que les deux traditionnelles, cette technique permet la séparation et la détection d’un plus large éventail de métabolites.
La métabolomique pourrait être appliquée à n’importe quel domaine de la biologie. Tout d’abord, pour parvenir à une compréhension plus profonde de la biochimie d’un organisme, et aider à expliquer leur réponse au stress abiotique ou biotique par rapport à la physiologie. Deuxièmement, associer les biomarqueurs à la perturbation à l’étude.
Comme l’alcool isopropylique est un solvant visqueux, il doit être introduit à faible taux de poussée, et suffisamment de temps d’équilibrage utilisé avant d’augmenter la composition à 98%Ces étapes empêcheront le système graphique chromatique de sur-pression, de retourner une erreur, ou potentiellement endommager la colonne analytique. Pour commencer la préparation des grains, utilisez un mélangeur de laboratoire pour moudre le grain. Faire fonctionner le mélangeur à grande vitesse pendant 20 secondes, puis répéter.
Retirer le pot du mélangeur de la base. Appuyez sur le côté du pot du mélangeur pour amener tout grain grossièrement moulu à la surface de l’échantillon. Le grain grossièrement moulu peut être jeté ou entreposé.
Transférer le grain finement moulu du mélangeur dans un tube de micro centrifugeuse en plastique de deux millilitres. Le même jour que l’extraction, préparer le solvant d’extraction, tel que décrit dans le manuscrit. Ensuite, pesez 200 milligrammes de grain finement moulu dans un tube de micro centrifugeuse de deux millilitres.
Ajouter 500 microlitres de solvant d’extraction au grain dans le tube. En outre, préparer un blanc en ajoutant 500 microlitres de solvant d’extraction à un tube vide. À l’aide d’un homogénéiseur, réglé à 6 500 RPM, mélanger le solvant et le grain pendant 20 secondes.
Ensuite, répétez encore 20 secondes. Ensuite, centrifugez le tube à quatre degrés Celsius et 16 100 fois G, pendant cinq minutes. Transférer le supernatant dans un tube en plastique de deux millilitres et conserver la pastille.
Répétez le processus d’extraction sur la pastille deux fois. Mélanger les trois supernatants, en donnant un volume total d’extrait d’environ 1,5 millilitres et mélanger par vortex. Pour faire un échantillon mis en commun de tous les extraits de grain à utiliser pour le contrôle de la qualité, transférez 55 microlitres de chaque extrait de grain dans un tube et un vortex de deux millilitres.
Ensuite, transférez 50 aliquots microlitres de cet échantillon mis en commun en flacons de verre. Transférer un aliquot de 50 microlitres de chaque extrait d’échantillon de grain sur des flacons de verre. Tel que décrit dans le manuscrit écrit, préparez les solutions qui seront nécessaires pour la spectrométrie de masse chromatographie liquide.
Le jour de l’analyse LCMS, préparez 100 millilitres d’acétylonitrile à 5 %, contenant 200 nanogrammes par millilitre de leucine enkephalin. Ajouter 950 microlitres de cette solution au flacon de verre contenant les 50 microlitres aliquot de l’extrait de grain. Mélanger le contenu dans le flacon par vortex.
Tout d’abord, mettre en place un étalonnage des instruments tel que décrit dans le manuscrit et le guide de l’utilisateur du fabricant. Ensuite, purgez et rincez le système de fluidité LC à l’aide de solvants de qualité LCMS, y compris la phase mobile et les solvants de lavage. Equilibrer le système LC en utilisant les conditions de démarrage de la méthode LC, en s’assurant que la pression de la colonne s’est stabilisée.
Configurer la table de séquence de l’instrument. Injecter du format sodium au début de la séquence de l’échantillon pour vérifier l’étalonnage de l’instrument. Analyser d’abord les blancs solvants et préparateurs, puis les échantillons de contrôle de la qualité mis en commun pour le conditionnement du système, puis la liste des échantillons randomisés.
Exécutez des échantillons de contrôle de la qualité à intervalles réguliers, sous forme de répliques techniques. Exécutez deux échantillons de contrôle de la qualité à la fin de la séquence. Pendant que la séquence est en cours d’exécution, vérifiez la qualité des données, y compris la précision de masse standard interne et la reproductibilité du signal.
Pour vérifier la reproductibilité du signal, l’inspection visuelle des spectres superposés devrait suffire. Quatre normes internes ont été incluses dans la solution utilisée pour préparer les extraits de grain. Au cours du LCMS, une bonne précision de masse et une reproduction unique des normes internes ont été observées pour les modes d’ionisation positifs et négatifs.
D’après l’analyse des blancs, 421 signaux en mode négatif et 835 signaux en mode positif ont été jugés être des artefacts. Ces signaux étaient présents dans les blancs à des intensités égales ou supérieures à 5 % de l’intensité unique moyenne des échantillons de grains. Après la suppression des artefacts et le filtrage supplémentaire des données, le mode négatif a retourné 483 fonctionnalités et le mode positif a retourné 523 fonctionnalités.
Environ 250 caractéristiques étaient biologiquement pertinentes et différaient considérablement en intensité entre les variétés de blé. Les mesures de contrôle de la qualité, telles que l’inclusion de blancs préparateurs, de normes internes et d’échantillons mis en commun, sont importantes à retenir dans ce protocole.
