Ce protocole présente de nombreux avantages par rapport à la métabolomique de levure actuellement utilisée car il a une spécificité élevée, une sensibilité élevée et peut également profiler de nombreuses classes différentes de métabolites, y compris des molécules isomériques, isobares, hydrophiles et hydrophobes. La méthode de trempe utilisée dans ce protocole arrête toutes les réactions enzymatiques tout en réduisant considérablement les fuites de métabolites des cellules. La bibliothèque MS1 intégrée à ce protocole est issé des différentes exécutions MS2.
Après une culture nocturne à 30 degrés Celsius et 200 tours par minute, déterminez le nombre de cellules de levure par millilitre de culture et ajoutez cinq millilitres de solution stock stérilisée de glucose à 20% à chacune des deux fioles d’Erlenmeyer contenant 45 millilitres de milieu YP autoclavé par flacon. Utilisez une pipette de transfert stérile pour ajouter cinq fois 10 à la septième cellule de levure à chaque fiole et faites pousser les cellules de levure pendant au moins 24 heures supplémentaires à 30 degrés Celsius à 200 tours par minute. Pour l’extraction des métabolites, après culture, prélever les cellules de levure par centrifugation et éliminer rapidement le surnageant.
Placez le tube sur de la glace carbonique et ajoutez deux millilitres de chloroforme de moins 20 degrés Celsius, un millilitre de méthanol de moins 20 degrés Celsius, un millilitre d’eau nano pure glacée et 200 microlitres de perles de verre lavées à l’acide 425 à 600 microns aux cellules. Lorsque les billes ont été ajoutées, placez le tube recouvert de papier d’aluminium dans un kit de support de tube en mousse avec un dispositif de retenue et vortex l’échantillon pendant 30 minutes à vitesse moyenne à quatre degrés Celsius pour faciliter l’extraction des métabolites. Ensuite, incuber le tube pendant 15 minutes sur de la glace avant de centrifuger l’échantillon pour permettre la séparation de la phase aqueuse supérieure des débris et des protéines et des phases organiques inférieures.
Utilisez une micropipette pour transférer environ 400 microlitres de la phase aqueuse supérieure dans un tube lavé et étiqueté de 1,5 millilitre contenant 800 microlitres d’acétonitrile de moins 20 degrés Celsius. Ensuite, centrifugez l’échantillon et transférez 800 microlitres de la partie supérieure du surnageant dans un flacon de spectrométrie de masse marqué pour un stockage de zéro degré jusqu’à l’analyse par spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide. Pour séparer les métabolites extraits, ultrasonez le flacon d’échantillon pendant 15 minutes, suivi de trois vortex de 10 secondes à température ambiante.
Après le vortex, placez le flacon dans la plaque de puits du chromatographe liquide et réglez la colonne à 45 degrés Celsius avec un débit de 0,25 millilitre par minute et la plaque de puits à zéro degré Celsius. Utilisez ensuite le tableau pour définir les gradients de chromatographie liquide pour l’analyse. Après la séparation, utiliser des volumes d’échantillon de 10 microlitres de l’injection dans les modes positif et négatif d’ionisation par électropulvérisation dans un spectromètre de masse équipé d’une ionisation par électropulvérisation chauffée pour identifier et quantifier les métabolites solubles dans l’eau.
À la fin de l’analyse, ouvrez les données brutes dans un logiciel d’analyse de composés approprié et utilisez la bibliothèque de fragmentation spectrale de masse pour faire correspondre les spectres de masse afin d’annoter les métabolites identifiés dans l’analyse. Les masses exactes du MS1 et les profils isotopiques peuvent également être identifiés pour permettre l’annotation des métabolites à l’aide de bases de données en ligne. Utilisez ensuite la bibliothèque de bases de données et de spectres pour rechercher les spectres MS2 des données brutes.
Le lendemain, après avoir trempé les cellules de levure, lavez soigneusement les cellules avec 15 millilitres de tampon ABC et collectez les cellules par centrifugation. Resuspendez la pastille dans un millilitre de tampon ABC frais et ajoutez 500 microlitres de la solution d’iodure de propidium aux cellules. Vortex l’échantillon trois fois pendant 10 secondes par vortex et incuber les cellules pendant 10 minutes sur de la glace à l’abri de la lumière.
À la fin de l’incubation, prélever les cellules par centrifugation et laver les cellules trois fois avec un millilitre de tampon ABC frais par lavage. Après le dernier lavage, ressuspendez la pastille dans 300 microlitres de tampon ABC frais et ajoutez 10 microlitres de la suspension cellulaire résultante à une lame de microscope. Utilisez un microscope à fluorescence pour capturer des images de contraste d’interférence différentielle et de microscopie à fluorescence des cellules avec les filtres réglés sur une longueur d’onde d’excitation de 593 nanomètres et une longueur d’onde d’émission de 636 nanomètres.
Ensuite, utilisez un programme d’analyse d’image approprié pour compter le nombre total de cellules dans les images en champ clair et en fluorescence, et pour déterminer l’intensité de fluorescence de la coloration pour les cellules individuelles. La méthode de trempe cellulaire modifiée cause des dommages significativement plus faibles à la membrane plasmique et à la paroi cellulaire que la méthode de trempe au méthanol non tamponné à moins 40 degrés Celsius. En effet, presque toutes les cellules soumises à la trempe à l’aide de la méthode modifiée présentent une émission de fluorescence rouge, caractéristique des cellules de levure dans lesquelles la membrane plasmique et la paroi cellulaire ne sont pas endommagées.
En revanche, presque toutes les cellules soumises à la trempe à l’aide de la méthode non tamponnée de 80% de méthanol à 40 degrés Celsius ont montré une émission de fluorescence verte, caractéristique des cellules de levure dans lesquelles la membrane plasmique et la paroi cellulaire sont considérablement endommagées. La méthode de trempe cellulaire modifiée provoque également une fuite significativement plus faible de métabolites solubles dans l’eau des cellules de levure que la méthode de trempe à 80% de méthanol non tamponnée à moins 40 degrés Celsius. Les valeurs de décalage temporel de rétention des étalons de métabolites solubles dans l’eau sont significativement plus faibles et les formes de pic sont nettement plus nettes pour la colonne de phase zwitterionique que pour la colonne de phase inverse.
Un autre avantage de la méthode de spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide est la possibilité d’utiliser la colonne de phase zwitterionique pour séparer efficacement différents métabolites solubles dans l’eau ayant diverses propriétés structurelles, physiques et chimiques. Assurez-vous de faire l’iodure de propidium dans l’obscurité et assurez-vous également de recueillir la phase supérieure sans perturber la phase moyenne. Si un MSP ne peut pas être annoté en raison de l’absence de la bibliothèque spectrale MS2, utilisez une RMN pour illustrer cette structure.
