Plus d’un million d’uniformes des gouttelettes sont produits sur le substrat de la taille d’un doigt. Et des molécules d’ADN unique sont distribuées au hasard dans chaque gouttelette. Le rendement protéique est proportionnel au nombre de molécules dans une gouttelette.
Notre technique peut être utilisée pour une mesure rapide et quantitative de l’activité enzymatique sans expression et purification compliquées des protéines. Pour commencer, placez un verre de couverture sur une grille de coloration et placez la grille dans huit hydroxyde de sodium molaire. Sonicate le verre de couverture et la grille de coloration pendant 15 minutes à température ambiante.
Retirer la grille de coloration de l’hydroxyde de sodium et rincer le verre de couverture avec de l’eau 10 fois. Séchez le verre de couverture avec un pistolet à air comprimé. Cuire ensuite et sécher le verre de couverture sur une plaque chaude à 200 degrés Celsius pendant cinq minutes.
Préparez une solution 0,05% aminosilane. Plongez le verre de couverture dans cette solution et incubez-le pendant une heure à température ambiante. Rincer le verre de couverture cinq fois à l’eau pure.
Ensuite, séchez le verre de couverture à l’aide d’un pistolet à air comprimé. Cuire sur l’assiette chaude à 80 degrés Celsius pendant cinq minutes. Placez le substrat en verre de couverture sur un mandrin sous vide personnalisé pour le revêtement de spin.
Distribuez de 70 à 90 microlitres de polymère CYTOP de type A au centre du substrat de verre. Puis faire tourner immédiatement le polymère. Le revêtement polymère initial endommage la qualité du tableau final des microchambres.
Distribuez le polymère au centre du verre de couverture sans introduire de bulles d’air. Ramasser le verre enduit en le tenant dans les coins et le placer sur une feuille d’aluminium. Cuire au four pendant 30 minutes à 80 degrés Celsius, puis pendant une autre heure à 200 degrés Celsius.
Distribuez 0,2 à 0,3 millilitres de photorésistant au centre du substrat. Enduire immédiatement le photorésistant à 6000 rpm pendant 60 secondes. Utilisez un lingette imbibé d’éthanol pour enlever l’excès de photorésistant des bords du substrat.
Cuire le substrat à 110 degrés Celsius pendant cinq minutes. Pour réhydrater le photorésiste, laissez le substrat reposer pendant 30 minutes à une humidité relative de 42 à 60% Chargez le substrat dans le gouttière du masque et exposez-le pendant 25 secondes en mode contact sous vide. Puis immerger le substrat dans le développeur pendant cinq minutes pour dissoudre le photorésiste exposé.
Rincer le substrat 10 fois à l’aide d’eau pure. Ensuite, séchez le substrat à fond à l’aide du pistolet à air comprimé. Placez le substrat dans la chambre de réaction de la machine à graver réactif-ion et gravez le cytop couvert photorésist avec le plasma d’oxygène.
Après la gravure, retirer le reste du photorésist en sonnant le substrat en acétone pendant cinq minutes à température ambiante. Puis sonicate le substrat en propanol pendant cinq minutes. Rincer, sonifier et rincer à nouveau le substrat à l’aide d’eau pure décrite dans le manuscrit.
Ensuite, séchez le substrat avec un pistolet à air comprimé. À l’aide d’un coupeur de bureau, coupez du ruban adhésif Kapton à double enduit dans les formes microcanal définies. Collez les morceaux de ruban adhésif coupés au fond d’une boîte de Pétri plate pour servir de maître pour le moulage du PDMS.
Verser le mélange PDMS dans la boîte de Pétri à motifs de bande. Ensuite, placez la boîte de Pétri dans une mini chambre à vide et désaérer le mélange PDMS pendant une à trois heures. Ensuite, placez la boîte de Pétri dans un four à 60 degrés Celsius et laissez-la toute la nuit pour guérir le PDMS.
Une fois que le PDMS a guéri, peler l’élastomer durci de la boîte de Petri et utiliser un coupeur à câble plat pour découper les blocs de microcanal PDMS. Perforez ensuite un trou à chaque extrémité de chaque microcanal. Le substrat précédemment préparé aura une zone pour le tableau de microchambre.
Placez le microcanal PDMS sur cette partie du substrat. Puis insérez une pointe de pipet de 200 microlitres dans l’un des trous du microcanal PDMS. Tout d’abord, préparez la solution de réaction CFPS dans un tube PCR.
Ensuite, à l’aide d’une pointe de tuyaut non filtrant de 200 microlitres, dessinez 10 microlitres de la solution. Insérez la pointe pipet dans le trou d’entrée du microcanal PDMS et poussez vers le bas sur le piston pipet jusqu’à ce que la solution déborde de la sortie de microcanal. Transférez l’appareil FemDA dans un bloc d’aluminium pré-réfrigéré.
Confirmez que la zone du réseau de microchambres passe rapidement de translucide à transparente. Dessiner 300 microlitres d’huile à chasse d’eau pré-réfrigérée et transférer immédiatement l’huile dans la pointe pipet du trou d’entrée de microcanal. L’huile de chasse d’eau se déplace dans la microcanal et extrudes la solution de réaction excédentaire située à l’extérieur des microchambres.
Retirez simultanément les deux pointes insérées de pipet de l’appareil. Déplacez immédiatement l’appareil du bloc d’aluminium au film de paraffine. Insérez la pointe de pipet préparée contenant l’huile d’étanchéité dans l’entrée du microcanal PDMS et injectez l’huile jusqu’à ce qu’elle déborde de la sortie.
Les gouttelettes de femtoliter sont scellées dans des microchambres individuelles par l’huile. Ouvrez l’image BF déconcentrée. Pour supprimer les arrière-plans continus lisses de chaque image, sélectionnez Soustraire l’arrière-plan du menu Processus.
Entrez 20 pour le rayon de balle roulante. Cochez la case Aperçu et sélectionnez Ok. Sélectionnez Oui lorsqu’on vous demande s’il y a à traiter toutes les images.
Ensuite, pour réduire le bruit, sélectionnez Processus, Filtres, Médiane. Entrez 2,0 pour le rayon en pixels. Cochez la case Aperçu et sélectionnez Ok.
Sélectionnez Oui lorsqu’on vous demande s’il y a à traiter toutes les images. Ensuite, sélectionnez Image, Ajuster, Seuil pour séparer les images des microchambres de l’arrière-plan de l’image. Dans le menu Plugins, sélectionnez FemDA, FemDA Analysis.
Entrez le nombre minimum et maximum approximatif de pixels d’une seule microchambre. La circularité minimale et maximale attendue des microchambres et les numéros d’image de début et d’extrémité, puis sélectionnez Générer un retour sur investissement pour détecter les microchambres. Les IA détectés avec succès sont affichés dans le menu popup ROITable.
Dans la fenêtre d’analyse FemDA, sélectionnez Appliquer le masque ROI. Examinez l’image pour voir si les microchambres ont été correctement détectées. Ouvrez l’image de fluorescence et amenez-la à l’avant.
Cliquez à nouveau sur Appliquer le masque ROI pour ajouter les ROM à l’image de fluorescence. Dans la fenêtre d’analyse FemDA, sélectionnez One-Shot pour analyser les données du point final de l’image. Entrez N pour le nombre de pixels haut de gamme pour utiliser les pixels haut de gamme de chaque retour sur investissement pour calculer l’intensité moyenne de la gouttelette correspondante.
Cliquez ensuite sur Mesurer l’intensité pour calculer les intensités moyennes de toutes les gouttelettes détectées. Le ROITable est mis à jour avec les nouvelles données de l’image de fluorescence et l’histogramme est affiché dans une nouvelle fenêtre. Exportez les données en cliquant sur le bouton Enregistrer sous forme de texte.
La solution fluorescente a été encapsulée dans les microchambres de FemDA et l’intensité de fluorescence, qui est corrélée avec la taille de gouttelette a été mesurée utilisant la microscopie. On a constaté que les gouttelettes avaient une répartition de taille étroite. L’image 3D reconstruite de la microscopie confoccale a également montré la taille cohérente de gouttelette au fil du temps.
Les gouttelettes sont restées stables à température ambiante sans perte d’évaporation ni contamination croisée chez les gouttelettes pendant au moins 24 heures. La protéine fluorescente mNeonGreen a été synthétisée dans FemDA. Et les données d’image de pile ont été analysées à l’aide de l’image simultanée déconcentré champ lumineux.
Puisque l’intensité de fluorescence de chaque gouttelette est mesurée de son rendement protéique, l’histogramme suggère fortement un nombre inégal de molécules d’ADN par gouttelette. La probabilité que des gouttelettes contiennent différents nombres de molécules d’ADN correspondait parfaitement à une distribution de Poisson. La synthèse de l’enzyme phosphatase alcaline a également été effectuée dans FemDA avec des images capturées toutes les cinq minutes.
La réaction a montré une distribution discrète semblable de l’intensité de fluorescence des gouttelettes à un moment plus tôt et les résultats d’histogramme ont vérifié que le nombre inégal des molécules d’ADN dans les gouttelettes. Une molécule d’ADN unique encapsulée dans des gouttelettes individuelles peut être encore récupérée, amplifiée et séquencée, ce qui rend possible le dépistage des protéines les plus élevées. Une technique de gouttelette comportant soit un petit volume et soit une stabilité élevée permet un diagnostic moléculaire rapide et précis des maladies cancéreuses avec des biomarqueurs spécifiques.
