Notre intervention chirurgicale permet l’édition génétique spécifique des cellules leptomeningeal pour étudier leur fonction dans beaucoup de conditions physiologiques et pathologiques telles que le neurodéveloppement et la diffusion de la méningite bactérienne. Pour minimiser les dommages lors de la livraison intra-citerne de l’endoxifène, nous utilisons une aiguille pliée qui peut être fixé contre le bord caudal du crâne pour l’empêcher de pénétrer plus profondément dans le tissu. La procédure peut être utilisée pour sonder le rôle des gènes exprimant les cellules leptomeningeal par la perte et le gain d’expériences de fonction.
Il peut également être adopté pour suivre le flux de liquide céphalo-rachidien. La démonstration visuelle de cette méthode assurera l’identification réussie du site d’injection pour l’injection intra-isternale et la compréhension sur la façon de fixer l’aiguille contre l’os occipital. Commencez par préparer une seringue Hamilton avec une aiguille biseauté de calibre 30 pour injection.
Utilisez des forceps pour plier l’aiguille à 30 degrés trois millimètres de la pointe. Ensuite, diluer l’endoxifène dans 10%DMSO à une concentration d’un milligramme par millilitre et remplir la seringue. Anesthésier l’animal dans la chambre isoflurane.
Ajustez ensuite le porte-tête de la souris de sorte que l’embout buccal soit approximativement à un angle de 30 degrés par rapport à la surface de la table chirurgicale et fixez la tête de l’animal sur le support. Pour améliorer l’accessibilité à la cisterna magna, placez le corps de l’animal à environ 30 degrés de la surface de la table avec la tête inclinée vers le bas qui établira un angle de 120 degrés avec le reste du corps et prolongera l’arrière du cou pour faciliter l’accès à la magna cisterna. Une fois que l’animal est bien positionné, appliquez l’onguent ophtalmique, rasez l’arrière de son cou, et assainiz la zone avec des lingettes d’alcool et de la bétadine.
Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour faire une incision à mi-ligne à partir du niveau de l’os occipital et s’étendant postérieurement. Séparez doucement le tissu conjonctif superficiel et les muscles du cou en tirant latéralement de la ligne médiane avec des pinces à pointe fine qui exposeront la membrane duralelying la magna cisterna. Placez un petit séparateur chirurgical pour permettre la visualisation de la magna cisterna tout au long de la procédure.
Identifiez l’extrémité caudale de l’os occipital et insérez l’aiguille précédemment pliée immédiatement en dessous. Une fois que le dura a été perforé, laissez la pointe pliée de l’aiguille pénétrer sous la surface en tirant doucement la seringue vers le haut et parallèlement au corps de l’animal qui assurera une meilleure stabilité. Injectez le composé lentement pour éviter les interférences avec le flux naturel du liquide céphalo-rachidien.
Après l’injection, laisser reposer l’aiguille à l’intérieur pendant une minute, puis l’enlever soigneusement à l’aide de forceps pointe fine. Fermez la peau avec quelques gouttes d’adhésif cyanoacrylate et appliquez l’anesthésie locale au site d’injection. Retirez l’animal du support et placez-le dans une cage propre sur un coussin chauffant.
Ensuite, assurez-vous de surveiller l’animal jusqu’à ce qu’il reprenne conscience. Injection intracisternale d’endoxifène chez des souris transgéniques exprimant CreER sous le promoteur Cx30, un reporter fluorescent inductible permet une recombinaison spécifique des cellules leptomeningeal sans étiqueter le Cx30 voisin exprimant des astrocytes de surface et des astrocytes parenchyrmaux dans le cortex. Ce protocole d’injection tire parti du mouvement physiologique du liquide céphalo-rachidien de sorte que la solution endoxifène est distribuée dans tout l’espace sous-arachnoïdien pour recombiner efficacement les cellules leptomeningeal superposant les bulbes olfactifs, le cortex et le cervelet.
La solution ne traverse pas la barrière méningéale du cerveau ou n’entre pas en contact avec les cellules astrogliales du parenchyme par opposition à l’administration systémique par gavage oral. La recombinaison des cellules leptomeningeal après injection intra-isternale a été identifiée par la réactivité de Pdgfr-alpha tandis que les astrocytes de surface et parenchymaux exprimant Gfap sont restés non étiquetés. Lorsque vous tentez cette expérience, il est important de localiser le site d’injection pour la livraison intra-citerne.
Cette démonstration visuelle fournit le savoir-faire technique pour effectuer la procédure tout en minimisant le risque d’endommager le tissu neuronal sous celui-ci. Des études d’ablation génétique peuvent être réalisées avec cette technique pour étudier le rôle des cellules leptomeningeal dans la corticogenèse et la régulation de la formation de fluide céphalo-rachidien et pour identifier d’autres sites pour la propagation des bactéries dans l’espace sous-arachnoïdien.
